抑制STAT5信號會影響骨肉瘤的生長和乾性
Suppressing STAT5 signaling affects osteosarcoma growth and stemness
研究表明JAK/STAT信號的失調促進了骨肉瘤（osteosarcoma，OS）的進展。匹莫齊特（pimozide，別名哌迷清），一種STAT5抑制劑，抑制了骨肉瘤細胞的增殖和克隆形成，並誘導了G0/G1期細胞阻滯和凋亡。cyclin D1和CDK2表達水平、Rb磷酸化和caspase 3、PARP的裂解減少。另外，匹莫齊特抑制了肺類器官體系中三維培養的骨肉瘤球狀培養物的形成與細胞的生長。而且，癌症幹細胞標記物蛋白DCLK1、CD44、CD133、Oct-4和ABCG2的表達減少了。更重要的是，是DCLK1短亞型在骨肉瘤球狀物中上調了，而用匹莫齊特處理後受到了抑制。作者進一步用流式細胞術確認了DCLK1+細胞數量的減少。而且，匹莫齊特抑制了OS細胞中STAT5、STAT3和ERK的磷酸化。分子對接研究證實，匹莫齊特與STAT5A和STAT5B的結合能量分別為-8.4和-6.4 Kcal/mol。這種分子結合通過細胞熱轉移分析（CETSA）得到了驗證。為了進一步理解STAT5的作用，作者用siRNA敲降了它的兩種亞型，使用匹莫齊特腹腔注射治療荷瘤小鼠（KHOS/NP腫瘤異種移植）21天。匹莫齊特治療顯著抑制了異種移植物的生長。WB和免疫組化分析也證明了幹細胞標記蛋白受到了顯著抑制。綜上，這些數據表明，匹莫齊特治療至少是部分通過抑制STAT5信號通路，靶向增值的腫瘤細胞和腫瘤幹細胞，從而抑制了OS生長。
圖1 匹莫齊特抑制骨肉瘤生長。 (A) 匹莫齊特的化學結構。(B) 用濃度逐漸（0–40 μM）增加的匹莫齊特培養KHOS/NP、MG63和SJSA-1細胞，並測定細胞增殖。與對照組相比，匹莫齊特治療導致所有細胞都呈現顯著的劑量和時間依賴性的細胞增殖減弱。 (C) KHOS/NP、MG63和SJSA-1細胞用10 μM匹莫齊特處理48小時後，用於生長並形成細胞群落（就是克隆形成實驗，翻譯出來怎麼怪怪的...）。匹莫齊特處理抑制了細胞群落形成。圖為三次獨立實驗的代表性結果。 (D-E) 20 μM 匹莫齊特特異性抑制KHOS/NP GFP陽性細胞，但是不抑制TiD體系（tumor-in-a-dish，是作者團隊此前構建的一種多細胞類型的肺類器官模型，這個TiD類器官包含永生性的上皮細胞和成纖維細胞，以及內皮細胞，因而創造了一個類似體內的腫瘤微環境，為OS細胞提供了必要的細胞-細胞接觸、組織結構和不同細胞類型的影響）中的正常細胞。比例尺：100 μm。
圖2 匹莫齊特誘導細胞周期阻滯和凋亡。（A）匹莫齊特處理細胞後進行周期分析。用20 μM匹莫齊特處理KHOS/NP和SJSA-1細胞24小時和48小時，之後用碘化丙啶（propidium iodide，PI）對DNA染色後上流式細胞儀檢測。兩種細胞中，匹莫齊特處理24小時和48小時都增加了G0/G1期阻滯。（B）用匹莫齊特（10和20 μM）與孵育細胞24小時後，通過測定caspase-3/7活性來評估細胞凋亡。匹莫齊特處理導致兩種細胞中的caspase-3/7活性都顯著增加（*p < 0.001）。（C）用20 μM的匹莫齊特處理細胞24和48小時，用WB細胞裂解物中caspase 3和PARP蛋白表達。兩種細胞系均顯示，在匹莫齊特處理後出現了caspase 3和PARP裂解。（D）經20 μM匹莫齊特處理的細胞的裂解產物用WB分析cyclin D1、CDK2和RB（成視網膜細胞瘤基因，DNA結合蛋白。在細胞周期的G1期，Rb蛋白在被Cyclin-CDK（一般是CyclinD/CDK4 or CyclinE/CDK2）磷酸化後變成p-Rb，然後才可以釋放結合在其上的E2F，E2F是轉錄因子，促進S期所必需的Cyclin（細胞周期蛋白）、CDK蛋白的轉錄，細胞才能從G1期進入S期）磷酸化水平。匹莫齊特抑制了兩種細胞系中cyclin D1、CDK2表達以及RB磷酸化水平。（E）用20 μM匹莫齊特處理24和48小時後，細胞裂解產物用WB分析抗凋亡和促凋亡蛋白。匹莫齊特處理導致了KHOS/NP和SJSA-1細胞中Bcl2和Bcl-XL表達的下降和Bax表達水平的上升。
圖3 匹莫齊特影響癌症幹細胞標記物表達。（A）在低粘附培養板中，將KHOS/NP和SJSA-1細胞培養在特異的球狀體培養基中，並用0–25 μM的匹莫齊特處理。5天後，對球狀體進行拍照並計數。比例尺：100 μm。（B）收集原代的細胞球並分離成單細胞，然後重新鋪板。匹莫齊特處理顯著抑制了骨肉細胞球體形成（*p < 0.05）。（C-D）與二維培養相比，三維培養物的裂解產物用WB分析顯示，兩種細胞系中的DCLK1短亞型都顯著升高。匹莫齊特抑制了DCLK1該亞型的表達。三維培養物的裂解物的WB分析結果顯示，與二維培養相比，兩種細胞系中顯著升高的CD44、CD133、Oct-4和ABCG2水平被匹莫齊特有效地抑制了。（E）KHOS/NP和SJSA-1細胞中抗-DCLK1抗體標記的藻紅蛋白（phycoerythrin）的流式細胞分選。24小時後，匹莫齊特處理導致了DCLK1陽性細胞數量的顯著降低。
圖4 匹莫齊特抑制STAT5磷酸化。（A）匹莫齊特與STAT5相互作用。通過分子對接測定出匹莫齊特可以與STAT5A和STAT5B的SH2結構域互作，結合能量分別為8.4 和6.4 kcal/mol。（B）細胞熱轉移實驗（cellular thermal shift assay，CETSA：該方法依據的原理是，靶蛋白在結合配體藥物分子後增加了結構的熱力學穩定性[1]）。用匹莫齊特處理KHOS/NP細胞，再用差異溫度處理3分鐘。最終的裂解產物用WB檢測其中的STAT5。匹莫齊特保護了STAT5，使其避免了熱變性，證明匹莫齊特與STAT5的相互作用。（C）匹莫齊特處理後的細胞的裂解產物引起了STAT5、STAT3和ERK磷酸化的顯著減少。
圖5 STAT5保護細胞避免匹莫齊特街道的細胞死亡. （A）用siRNA幹擾STAT5A、STAT5B或者同時幹擾兩者，處理72小時。裂解物中STAT5用WB分析。敲降STAT5A或者STAT5B減少了STAT5蛋白的水平，其中，幹擾STAT5B產生的影響更明顯。（B）轉染siRNA幹擾STAT5A和STAT5B的或者同時幹擾兩者，處理48小時，隨後用PI染色後用流式細胞術分析細胞周期。敲降STAT5蛋白不影響骨肉瘤的細胞周期進程。（C）siRNA幹擾STAT5A、STAT5B或者同時幹擾兩者，再用10 μM匹莫齊特處理。己糖胺酶試驗測定細胞增殖發現，敲降STAT5減弱了骨肉瘤細胞增殖。（D）siRNA幹擾STAT5A、STAT5B或者同時幹擾兩者，處理48小時後用10 μM匹莫齊特處理24小時。WB分析裂解產物中STAT5和capase 3水平。敲降STAT5A或者STAT5B進一步增強了匹莫齊特介導的caspase 3裂解。（E）siRNA幹擾STAT5A、STAT5B或者同時幹擾兩者，再用匹莫齊特處理。Annexin V/PI染色後用流式細胞儀分析。匹莫齊特處理顯著誘導了細胞的壞死和晚期凋亡。然而，STAT5B的敲降減少了匹莫齊特介導的壞死，但導致了凋亡的進一步增加。
圖6 匹莫齊特抑制KHOS/NP骨肉瘤異種移植物的生長. （A）實驗計劃。（B）KHOS/NP細胞注射進裸鼠側腹部位，經7天時間形成明顯可見的瘤體。隨後，每天用匹莫齊特（10 mg/kg體重）腹腔注射，持續21天。每周測量瘤塊大小。第22天，切除瘤塊並作進一步分析。（C）匹莫齊特處理沒有減少了動物體重。 （D）匹莫齊特治療的小鼠的瘤塊腫瘤比對照組的更小（*P < 0.004）。（E） 匹莫齊特顯著減少了腫瘤體積（*P < 0.001）。誤差線代表±SEM，每組5隻小鼠。*P < 0.05，Student’s t檢驗。
圖7 匹莫齊特抑制腫瘤異種移植體組織中cyclin D1、癌症幹細胞標記物和STAT5信號蛋白。（A）WB（C1-4為對照組腫瘤異種移植物組織，P1-4為匹莫齊特治療的異種腫瘤移植物）和（B）免疫組化分析表明，在匹莫齊特治療的動物的組織裂解物中，cyclin D1表達水平顯著更低。比例尺：40 μm。（C）WB（C1-4為對照組腫瘤異種移植物組織，P1-4為匹莫齊特治療的異種腫瘤移植物）和（D）免疫組化分析表明， 在匹莫齊特治療的動物的組織裂解物中，癌症幹細胞標記物DCLK1、CD44和ABCG2的表達水平顯著更低。比例尺：40 μm。（E）WB（C1-4為對照組腫瘤異種移植物組織，P1-4為匹莫齊特治療的異種腫瘤移植物）和（F）免疫組化分析表明，在匹莫齊特治療的動物的組織裂解物中，STAT5的磷酸化水平顯著更低。比例尺：40 μm。
總體來說，這個文章是思路其實比較傳統，似乎並沒有什麼高大上的東西。使用的方法除了細胞熱轉移分析（CETSA）這個手段，其他的也沒有啥特別的。使用的工具方面，個人覺得類器官是這個研究的亮點了。而且，他們的這個類器官不是直接用骨肉瘤組織或者骨肉瘤幹細胞直接製備的類器官，而是用越1000多個人正常肺上皮細胞、正常肺成纖維細胞、臍靜脈內皮細胞和正常淋巴管內皮細胞與KHOS/NP GFP陽性細胞共同混合後培養形成的。但是話說回來，為什麼不直接做骨肉瘤類器官呢？因為不是很好做？這個類器官僅僅是用來證明匹莫齊特對正常細胞沒啥影響？有點大材小用了。
帶著這個問題，我找了一些資料發現，骨肉瘤復發率和轉移率都非常高，而且最容易轉移到肺部。骨肉瘤類器官的研究報導還非常少，目前只發現一篇，而且也是主要研究肺轉移的骨肉瘤樣本製備的類器官，原位骨肉瘤樣本僅有一例[2]（這個文獻考慮下期講解）。在這個研究中作者發現Cut/EnBloc法難以培養出原位骨肉瘤來源的類器官。雖然作者說用單細胞法可以製備出相應的類器官，但是根據老編的淺薄認識，那個就算是類器官，生長狀態也是很糟糕的。基於這些信息，我的猜測是很多骨肉瘤確診時已基本發生轉移，而且原位骨肉瘤類器官培養失敗率很高，所以在今天講解的這個文獻中，作者採用了大雜燴型的類器官把KHOS/NP骨肉瘤細胞包裹起來，來研究匹莫齊特在體內的可能的效果。
另外，關於荷瘤實驗，不是說直徑超過2釐米的瘤塊就違反倫理了嗎？那個瘤體起碼直徑超過5釐米了吧？這麼肥美是怎麼回事？！（有同樣質疑的，可以發個郵件給雜誌社，看看會不會撤稿？）
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https://sci-hub.ren/10.1038/s41419-020-2335-1
參考文獻
1. Molina D M, Jafari R, Ignatushchenko M, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay[J]. Science, 2013, 341(6141): 84-87.
2. He A, Huang Y, Cheng W, et al. Organoid culture system for patient-derived lung metastatic osteosarcoma[J]. Medical Oncology, 2020, 37(11): 1-9.