華夏聯盟編者按：
這是一個很重要的轉化研究。Science近日發文指出，實驗室爭相生產新型冠狀病毒診斷試劑，缺乏抗體檢測掩飾了診斷正確性。國家藥監局近日新批准兩個新冠病毒感染抗體檢測試劑，這對疾病確診和進一步控制疫情的意義重大。
本周剛在國際期刊Emerging Microbes & Infections (EMI) (中文譯名《新發微生物與感染》) 發表的一篇發自武漢臨床前線的報告發現，新冠病毒在身體多部位採集到樣本後，雖然可以用分子生物學檢測到病毒存在，但這些部位的檢出陽性率都不高。這個實驗裡的病人都沒有從支氣管下部採集標本，而這次新冠病毒的主要感染位置是下呼吸道。這個報導解釋了前一段臨床檢測病毒感染陰性陽性不定的困惑。同時這篇報導發現在發病後第5天，100%的病人都可以在血清裡查到針對病毒的抗體反應。根據這一發現，及時進行血清特異抗體檢測應該是能大大提高臨床病毒感染診斷的有效手段。
摘要
2019年11月，一種新型冠狀病毒（2019-nCoV）在中國武漢爆發，並迅速蔓延至世界各地。2019-nCoV最初被認為通過呼吸道傳播並導致肺炎，因此以口腔拭子為基礎的分子學診斷被用於確認是否感染。同樣，兩次口腔拭子檢測陰性的患者即可出院。然而，許多冠狀病毒也可感染腸道並通過糞-口途徑傳播，此次2019-nCoV是否入侵被感染者的其他器官仍有待檢測。筆者在武漢當地一所醫院對感染此病毒的患者進行研究，發現肛門拭子和血液中也存在2019-nCoV，且在感染後期肛門拭子陽性率高於口腔拭子陽性率，這說明病毒可通過糞-口途徑傳播。筆者還發現血清學檢查可以提高檢測的陽性率，應當在未來的流行病調查中使用。本文旨在提出警示：2019-nCoV可能通過多種途徑散播。
引言
冠狀病毒（Coronaviruses, CoVs）屬於套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）中的正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）。2003年，一種人類冠狀病毒（SARS-CoV）導致嚴重急性呼吸綜合症（severe acute respiratory syndrome, SARS）的爆發。最近，一種SARS相關CoV被認為是導致中國中部城市武漢疫情爆發的病原體。據估計，該疫情於2019年12月12日開始，截至2020年2月3日，中國的實驗室確診病例為17332例，累計死亡361例[1]。該病毒已經通過來自武漢的旅客傳播到其他23個國家[1]。典型的症狀為發熱、乏力、氣促，嚴重的情況下出現肺炎[2-4]。這種疾病最初被稱為「不明原因病毒性肺炎」。
筆者很快確定了病原體，並將它命名為2019-nCoV（世界衛生組織指定的病毒名稱）。新發現的病毒是SARS相關病毒（SARSr-CoV），但其與SARS-CoV的基因組同源性僅為74.5%[2]。筆者開發了基於病毒刺突基因的分子檢測工具。筆者此前的研究表明，qPCR方法可用於口腔拭子或支氣管肺泡灌洗液中2019-nCoV的檢測[5]。此外，筆者利用另一種SARSr-CoV Rp3來源的交叉反應核衣殼蛋白（nucleocapsid protein, NP）開發了IgM和IgG檢測方法[6]，該蛋白與2019-nCoV的NP具有92%的同源性。使用這些血清學工具，筆者證明感染2019-nCoV患者的病毒抗體滴度增加[5]。
臨床觀察顯示，與SARS-CoV相似，2019-nCoV通過呼吸道引起肺炎。因此，口腔拭子中病毒抗原的存在可被用作2019-nCoV的檢測標準。同樣，以24小時為間隔的兩次口腔拭子陰性被正式視為病毒清除。本文對武漢市某醫院的2019-nCoV進行了調查，旨在探討該病毒可能存在的其他傳播途徑。
材料與方法
樣本採集
口腔拭子、肛門拭子和血液樣本在所有患者知情同意並由新發傳染病定點醫院倫理委員會批准後，在武漢市肺科醫院採集。共進行了兩次研究。在第一次研究中，筆者收集了39例患者的樣本，其中7例病情嚴重。在第二次研究中，筆者收集了139名患者的樣本，但沒有他們的臨床記錄。筆者只展示病毒核苷酸檢測陽性的患者。除有特殊標註外，患者選擇均無性別或年齡偏倚。對於拭子，每管加入1.5 ml DMEM+2% FBS培養基。2500rpm渦旋60s靜置15 - 30分鐘後收集上清液。將拭子上清加入裂解緩衝液以提取RNA。收集的血清在24h內3000 g離心15 min, 然後56℃30 min滅活，最後4℃保存直到使用。
RNA提取和實時定量PCR
筆者嚴格按照商業試劑盒的說明書進行操作。應用高純度病毒RNA提取試劑盒（羅氏）從200μl的樣本中提取病毒RNA。RNA用50μl洗脫緩衝液來洗脫用作RT–PCR模板。基於之前報導過的2019-nCoV S基因的檢測方法來進行qPCR檢測[5]。簡單來說，以上提取的RNA由HiScript®II One Step qRT-PCR SYBR®Green 試劑盒來提取。20μl qPCR反應體系包含10μl 2×SYBRGreen Mix，1μl One Step SYBR Green Enzyme Mix，0.4μl 50×ROX Reference Dye 1，0.4μl(10μM)每對引物和2μl RNA模板。擴增過程如下：50℃持續3 min, 95℃持續30 s, 接著進行95℃持續10 s, 60℃持續30 s的40個循環，最後使用ABI 7500的PCR儀上默認的熔解曲線。
血清學檢測
採用SARSr-CoV Rp3 NP作為抗原（據之前報導該抗原與所有SARSr-CoV具有90%以上的胺基酸同源性[5]）筆者自主開發了內部應用的抗SARSr-CoV IgG和IgM ELISA的試劑盒。對於IgG檢測，MaxiSorp Nunc-immuno 96 孔的 ELISA板用重組NP包被過夜(100 ng/孔)。將人血清1:20稀釋置於37°下1小時進行檢測。抗人IgG-HRP標記的單克隆抗體(Kyab生物技術股份有限公司，武漢，中國)按1:40000稀釋加入。計算OD值(波長450-630)。對於IgM抗體的檢測,MaxiSorp Nunc-immuno 96 孔ELISA板用抗人IgM(μ鏈)(500 ng /孔)包被過夜。將人血清1:100稀釋後置於37°下40 min進行檢測，最後加入稀釋1:4000抗Rp3 NP-HRP偶聯物(Kyab生物技術股份有限公司，武漢，中國)。計算OD值(波長450-630)
結果
第一部分研究中，為了測試肛門拭子和血液中是否如同口腔拭子一樣可以檢測到病毒陽性，筆者對收治於武漢肺科醫院的2019-nCoV口腔拭子陽性患者進行了分子學研究，採集了血液、口腔拭子和肛門拭子樣本進行2019-nCoV 的qPCR檢測，方法如前所述[5]。
在15名接受治療數日仍攜帶病毒的患者中，8人口腔拭子陽性（53.3%），4人肛門拭子陽性（26.7%），6人血液陽性（40%），3人血清陽性（20%）；2名患者同時存在口腔拭子和肛門拭子陽性，然而不存在血液和拭子同時陽性的患者。血清陽性的患者不出意外地均為血液陽性（見表1）。總之，即使口腔拭子中無法檢測到病毒核苷酸的患者，仍可能存在肛門拭子或血液病毒核苷酸陽性。筆者應當注意的是，即使拭子病毒陰性，患者也有可能存在病毒血症。
接著，筆者在另一組入院治療10天的患者中連續觀測口腔拭子和肛門拭子中病毒的動態變化情況，檢測了病毒抗體和病毒核苷酸水平，方法如前所述[5]。結果顯示，第0天（初次採集樣本）IgM和IgG的滴度都相對較低或檢測不到。第5天，幾乎所有患者都出現了病毒抗體水平的升高，這通常被認為是早期感染向晚期感染的過渡（見圖1和附表1）。IgM陽性率從50%（8/16）升高到81%（13/16），而IgG陽性從81%（13/16）升高到了100%（16/16），這與分子學檢測（如下）的低陽性率相悖。
分子學檢測結果顯示第0天16名患者中共有8人口腔拭子陽性（50%）和4人肛門拭子陽性（25%）。第5天，僅有4人口腔拭子陽性（25%），相反地，檢測到6人肛門拭子陽性（37.5%）。合併所有拭子陽性結果分析，筆者發現第0天大多數拭子檢測陽性來自於口腔拭子（8/10，80%）。然而，此趨勢在第5天發生改變，肛門拭子陽性率（6/8，75%）高於口腔拭子陽性率（4/8，50%），同時筆者還發現6名第0天拭子檢測陰性的患者再次出現了病毒。值得注意的是，這6名患者中4人為肛門拭子陽性（見表2）。這些數據提示了拭子檢測存在著由早期較多口腔拭子陽性（由抗體滴度表明）向晚期較多肛門拭子陽性變化的情況。
討論
在2019-nCoV病毒爆發後的1個月內，筆者迅速開發了分子和血清學檢測工具。這是首次從7名確診為不明病毒性肺炎的患者中初步鑑定為2019-nCoV後對該病毒進行的分子和血清學研究[5]。筆者在口腔拭子、肛門拭子和血液中都檢測到該病毒，因此受感染的患者可能通過呼吸道、糞-口或體液途徑傳播該病原體。此外，筆者還成功地應用血清學方法對大量人群進行了檢測，結果表明，該方法可以大大提高檢測的陽性率。
筆者發現，目前用於2019-nCoV診斷的口腔拭子中病毒RNA的檢測策略並不完善。當口腔拭子檢測陰性時，通過肛門拭子或血液學方法可以檢測到該病毒。在SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒感染的患者中，觀察到在感染後期這些患者存在腸道感染[7-9]。然而，感染2019-nCoV的患者在疾病的早期或晚期可能在腸道內藏有病毒。值得注意的是，病毒血症的患者血液標本均未檢測出陽性。通過常規監測，這些患者可能被認為未感染2019-nCoV，從而對其他人構成威脅。相比之下，筆者幾乎在所有患者血清中都發現了病毒抗體，表明流行病學應該考慮2019-nCoV的血清學。筆者可以觀察到從早期感染時的口腔拭子陽性到晚期感染時的肛門拭子陽性的可能轉變，這一觀察結果表明，臨床上不能僅僅基於口腔拭子陰性便允許患者出院，因為患者仍可能通過口-糞途徑排出病毒。最重要的是，考慮到口腔拭子檢測結果不可靠，筆者強烈建議使用病毒IgM 和IgG血清學試驗來確認感染。
綜上所述，筆者在此提出警示：2019-nCoV可能通過多種途徑傳播，分子和血清學測試都是確定病毒感染所必需的。
致謝
感謝杜克-新加坡國立大學醫學院Danielle Anderson教授對本文提出的批評和建議，感謝武漢病毒所國家病毒資源中心。
/翻譯：吉林大學第一醫院 湛夢茹 任天羿 劉旭 李臘梅
/編輯：臨床肝膽病雜誌 邢翔宇