國家蛋白質中心團隊:蛋白質晶片揭示早期新冠患者血清抗體的規律

2020-12-03 BioArt生物藝術

責編丨兮

截至4月28日，新型冠狀病毒SARS-CoV-2已經蔓延到全球超過200個國家或地區，累計國外報告確診病例超過300萬，累計死亡超過20萬人例。尤其是新冠病毒感染攜帶者和早期新冠肺炎患者，他（她）們的症狀輕、隱匿性強，無法全部得到及時有效的檢測，給世界各國的疫情防控帶來的巨大的挑戰！新冠病毒編碼20餘種蛋白，在感染人體後會迅速被人體免疫系統識別，產生大量的抗體。如何在蛋白質組水平全面揭示新冠肺炎早期患者血清中的病毒抗體表達水平和變化規律，鑑定用於新冠肺炎早期檢測抗體標誌物分子，進而開發出快速診斷試劑對於今後開展新冠病毒感染者的及時檢測和治療具有非常重要的價值。

2020年3月28日，國家蛋白質科學中心-北京（鳳凰中心）於曉波研究員/北京協和醫院李永哲教授在預印版平臺bioRxiv上發表文章SARS-CoV-2 proteome microarray for mapping COVID-19 antibody interactions at amino acid resolution【1】（於曉波/李永哲合作團隊研發出可實現胺基酸水平血清抗體全景式掃描的SARS-COV-2蛋白質組晶片），設計和開發出了SARS-CoV-2病毒全蛋白質組多肽晶片。該晶片包含966個多肽和純化的N、S和E蛋白探針，只需要1.5個小時就可實現對新冠病人血清血漿中結合到SARS-CoV-2病毒蛋白胺基酸序列的抗體進行全景式的掃描。該晶片可廣泛用於新冠病毒抗體的大規模檢測，免疫反應動態監測，抗體試劑和藥物的表位分析，發現診斷標誌物抗體和治療性抗體等。

2020年4月20日，該團隊在預印版平臺medRxiv上再次發表文章Proteome-wide analysis of differentially-expressed SARS-CoV-2 antibodies in early COVID-19 infection【2】，全面系統地檢測和分析了早期新冠肺炎患者和疑似患者血清中新冠病毒抗體的表達和分布規律（圖1）。

圖1. SARS-CoV-2全蛋白質組學晶片全面分析早期新冠肺炎患者血清抗體流程的示意圖。

首先，他們採用SARS-CoV-2全蛋白質組晶片篩選了40例早期輕症新冠肺炎患者、流感和非流感疑似患者的血清，分析和鑑定了針對早期新冠肺炎特異性表達的IgM和IgG病毒抗體（圖2）。

圖2. SARS-COV-2蛋白質組晶片檢測早期新冠和疑似患者的差異表達抗體。（a）和（b）分別為早期新冠和疑似患者的差異表達IgM和IgG抗體

結果發現：1）針對新冠肺炎產生的特異性IgM抗體主要為S蛋白。而IgG抗體可以是N蛋白、S蛋白和Orf1ab蛋白；2）初診新冠患者對於不同新冠病毒抗原具有很大的偏向性。其中N抗原免疫原性很強，檢測的靈敏較低。而S抗原對於早期新冠肺炎的檢測特異性和靈敏度更好，但是對於IgM和IgG抗體具有偏向性。其中IgM抗體最好的標誌物為S1+S2ECD或者S1-RBD蛋白，IgG抗體最好的抗體標誌物可以是S2ECD和S1+S2ECD蛋白（圖3）。

圖3. 新冠病毒N和S蛋白在早期新冠肺炎患者和臨床疑似患者血清中的表達水平分析。（a）和（b）分別為N和S蛋白的人IgM和IgG血清抗體的差異表達。*，**，***分別為p值0.05,0.01和0.001.

通過進一步結構解析發現IgM的S2ECD的抗體表位主要分布在蛋白的外側表面，而IgG的S蛋白兩個抗體表位分別分布在蛋白表面和內部。而N蛋白的IgG抗體表位以帶狀分布在表面，很好地形成了抗體的結合位點（圖4）。

圖4. 結構分析N蛋白和S蛋白的抗體表位分布。（a）和（b）分別為IgM和IgG新冠病毒抗體表位在N和S蛋白結構上的位置。黃色為抗體表位，紅色箭頭指示抗體表位在蛋白結構上的位置。

結合SARS-CoV-2全蛋白質組晶片發現的蛋白和多肽標誌物分子（圖2），可以通過檢測IgM和IgG抗體標誌物區分87%和73%的早期新冠肺炎和疑似患者，大大高於目前已有的抗體檢測試劑的性能（7%-53%）（圖5）。以上結果表明SARS-CoV-2全蛋白質組晶片鑑定的標誌物分子可以用於開發出快速血清學檢測試劑，進而開展新冠病毒無症狀攜帶者和早期新冠肺炎患者的篩查。

圖5. SARS-CoV-2蛋白質組晶片鑑定的標誌物與不同廠家抗體檢測試劑的陽性率比較。Microarray: 蛋白質晶片；Chemoluminescence：化學發光法；ELISA: 酶聯免疫法；Immunocolloidal Gold Strip: 膠體金試紙條法。#1-#7 為不同廠家。

最後，他們對新冠肺炎抗體標誌物和臨床數據進行了關聯性分析。結果發現新冠肺炎抗體標誌物的表達水平與病毒感染的臨床指標顯著性相關。另外，新冠肺炎抗體標誌物表還還與心肌損傷的臨床指標（NT-proBNP和CKMB-mass）密切相關（圖6）。以上結果不僅為開發用於早期新冠肺炎檢測的高靈敏度血清學試劑指明了方向，而且對於理解新冠病毒抗體的功能和開展臨床治療具有重要的參考價值。

圖6. 新冠肺炎患者特異性病毒抗體與臨床指標的關聯性分析。（a）和（b）分別為新冠肺炎患者特異性IgM和IgG病毒抗體與臨床指標的關聯性結果。（c）和（d）新冠患者特異性IgM和IgG病毒特異性抗體與急性心肌損傷指標（NT-proBNP和CKMB-mass）具有顯著相關性。

參考文獻

1. Hongye Wang, Xin Hou, Xian Wu, Te Liang, Xiaomei Zhang, Dan Wang, Fei Teng, Jiayu Dai, Hu Duan, Shubin Guo, Yongzhe Li, Xiaobo Yu. SARS-CoV-2 proteome microarray for mapping COVID-19 antibody interactions at amino acid resolution.bioRxiv2020.03.26.994756; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.26.994756.

2. Xiaomei Zhang, Xian Wu, Dan Wang, Minya Lu, Xin Hou, Hongye Wang, Te Liang, Jiayu Dai, Hu Duan, Yingchun Xu, Yongzhe Li, Xiaobo Yu. Proteome-wide analysis of differentially-expressed SARS-CoV-2 antibodies in early COVID-19 infection.medRxiv2020.04.14.20064535; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.14.20064535.

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