2016年3月14日/生物谷BIOON/--在一種新的研究中，來自美國格拉斯通研究所的研究人員將二十一世紀兩種最為強大的工具結合在一起，首次利用改進的CRISPR-Cas9系統，修改了誘導性多能幹細胞（iPSCs）基因組被讀取的方式。相關研究結果於2016年3月10在線發表在Cell Stem Cell期刊上，論文標題為「CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs」。
在這項研究中，研究人員採用一種被稱作CRISPRi（CRISPR interference, CRISPR幹擾）的CRISPR改進版讓iPSCs和源自iPSCs的心肌細胞中的基因失活。這種方法由當前這篇論文的共同作者Stanley Qi博士於2013年首次報導，它允許更加準確地和高效地沉默或者說關閉基因，從而顯著地改進了CRISPR-Cas9系統。CRISPRi也可以靈活地逆轉基因抑制和調整基因抑制程度。
標準的CRISPR系統利用蛋白Cas9在細胞DNA上進行切割，從而準確地刪除基因組中的靶序列。基於這種系統的CRISPRi使用一種由兩種蛋白組分融合在一起而形成的蛋白：一種組分是一種可經強力黴素（doxycycline）誘導而失活的Cas9蛋白版本（dCas9），另一種組分是蛋白KRAB的抑制結構域。為此，研究人員將編碼dCas9的基因和編碼KRAB抑制結構域的基因融合在一起，形成被稱作融合基因dCas9-KRAB的抑制基因，並將該融合基因導入AAV病毒載體中，然後就利用該病毒載體轉導宿主細胞（如iPSCs和源自iPSCs的心肌細胞），從而在宿主細胞中表達這種融合蛋白。所產生的融合蛋白停留在基因組靶位點上，抑制基因表達而無需切割DNA。令研究人員吃驚的是，以這種方式暫時地沉默基因表達要比永久性地切割基因組具有更好的準確性和更高的效率。
論文通信作者Bruce Conklin博士說，「我們對這兩種系統在性能上存在的顯著差異感到吃驚。我們原以為永久性地切割基因組可能能夠更加高效地沉默基因，但是事實上，CRISPRi是如此準確地和如此緊密地結合到基因組上以至於它確實是一種更好的基因沉默方法。」
在這項研究中，研究人員比較了CRISPRi和CRISPR-Cas9如何沉默一種控制iPSCs多能性---iPSCs分化為多種類型細胞的能力---的特定基因。他們發現CRISPRi要比CRISPR-Cas9更加高效：CRISPRi能夠讓95%以上的細胞中的靶基因沉默，而相比之下，CRISPR-Cas9隻能讓60%～70%的細胞中的靶基因沉默。而且，除了靶基因外，CRISPRi不會導致其他基因的表達發生變化，如不會導致細胞基因組產生不想要的序列插入或刪除，而這正是CRISPR-Cas9技術的令人擔憂之處。
CRISPRi也好比是一種撥動開關，能夠讓研究人員通過簡單地移除讓抑制基因dCas9-KRAB處於開啟狀態的強力黴素而逆轉基因抑制。此外，他們能夠通過改變他們加入的強力黴素數量來調整他們在多大程度上沉默一種基因。這些結果都有助於人們對某些基因在影響發育和疾病中發揮的作用進行更加多樣化的研究。
研究人員在iPSCs、T細胞以及由iPSCs分化而成的心肌細胞中證實了CRISPRi的強大能力。比如，他們利用CRISPRi的基因組編輯能力抑制對心臟功能必不可少的基因而構建出心臟病模型。
論文第一作者Mohammad Mandegar博士說，「CRISPRi在製造疾病相關的細胞類型中具有重大的優勢。利用這種技術，我們能夠在利用iPSCs製造出的純的心臟細胞群體中模擬疾病。這種疾病建模允許我們更加輕鬆地研究遺傳病和潛在地鑑定出新的治療靶標。」（生物谷 Bioon.com）
本文系生物谷原創編譯整理，歡迎轉載！點擊 獲取授權 。更多資訊請下載生物谷APP。
CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs
doi:10.1016/j.stem.2016.01.022
Mohammad A. Mandegarcorrespondenceemail, Nathaniel Huebsch, Ekaterina B. Frolov, Edward Shin, Annie Truong, Michael P. Olvera, Amanda H. Chan, Yuichiro Miyaoka12, Kristin Holmes, C. Ian Spencer, Luke M. Judge, David E. Gordon, Tilde V. Eskildsen, Jacqueline E. Villalta, Max A. Horlbeck, Luke A. Gilbert, Nevan J. Krogan, Søren P. Sheikh, Jonathan S. Weissman, Lei S. Qi, Po-Lin So, Bruce R. Conklin
Developing technologies for efficient and scalable disruption of gene expression will provide powerful tools for studying gene function, developmental pathways, and disease mechanisms. Here, we develop clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference (CRISPRi) to repress gene expression in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). CRISPRi, in which a doxycycline-inducible deactivated Cas9 is fused to a KRAB repression domain, can specifically and reversibly inhibit gene expression in iPSCs and iPSC-derived cardiac progenitors, cardiomyocytes, and T lymphocytes. This gene repression system is tunable and has the potential to silence single alleles. Compared with CRISPR nuclease (CRISPRn), CRISPRi gene repression is more efficient and homogenous across cell populations. The CRISPRi system in iPSCs provides a powerful platform to perform genome-scale screens in a wide range of iPSC-derived cell types, dissect developmental pathways, and model disease.