Nat Biotech丨pegRNA效率預測及設計原則

撰文 | 木蘭之枻

責編 | 兮

2019年底，哈佛大學David Liu實驗室開發出全新的精準基因編輯策略--引導編輯（prime editing），並設計出一系列的編輯工具PEs，該策略無需額外的DNA模板，只藉助改造後的嚮導RNA—pegRNA，便可有效實現四種鹼基之間的自由替換，這很好的彌補了現有單鹼基編輯工具的不足；此外，引導編輯還能實現目標位點鹼基的精準插入與刪除（插入的鹼基長度可達44bp，刪除的鹼基長度可達80bp）（專家點評Nature | David Liu再出重磅基因編輯新工具，可實現鹼基隨意轉換與增刪）【1】。有鑑於鹼基點突變及插入缺失突變可涵蓋大部分人類致病遺傳變異【2】，引導編輯在生物醫學的基礎研究和臨床基因治療研究中極具潛力。不過目前引導編輯研究仍處於起步階段，其編輯效率的影響因素不明，pegRNA的設計和篩選依然有賴於實驗驗證，難以通過計算模型進行有效預測，這極大的限制了其應用。

2020年9月21日，韓國延世大學醫學院Hyongbum Henry Kim實驗室在Nature Biotechnology雜誌上發表了題為Predicting the efficiency of prime editing guide RNAs in human cells的論文。文章通過高通量分析，對影響引導編輯效率的各種因素進行了系統評估，並在此基礎上開發出三種計算模型，可有效預測不同pegRNA的編輯效率。本研究為引導編輯pegRNA的設計和篩選提供了全新的工具，這對引導編輯的未來應用有重要意義。

引導編輯工具的核心組分是Cas9切口酶與逆轉錄酶融合而得的融合蛋白，以及sgRNA改造後得到的pegRNA。由於PE2在引導編輯工具中最具代表性，其編輯效率研究更具指導意義。引導編輯的效率研究中，pegRNA的設計相當關鍵：與sgRNA相比，pegRNA的3』端序列增加了兩段序列，序列一為引物結合位點（PBS），可與斷裂的靶DNA鏈3』末端互補以起始逆轉錄過程，序列二則是逆轉錄模板（RT模板），攜有目標點突變或插入缺失突變以實現精準基因編輯（圖1）。

圖1 改造後的pegRNA結構 【1】

研究者首先構建出包含48000組pegRNA與靶位點的慢病毒文庫（其中靶序列2000種，每種靶序列含24種PBS和RT模板組合，即六種PBS長度（7,9,11,13,15,17bp）和4種RT模板長度（10,12,15,20bp））。隨後研究者系統性評估了PE2系統對該文庫的編輯特徵，結果顯示，PE2-pegRNA的編輯效率與Cas9-sgRNA在目標位點的編輯活性有一定相關性。此外，研究還發現，PBS及RT模板的長度對PE2的效率有明顯影響。總體而言，pegRNA的初篩宜選擇長度為13bp的PBS和12bp的RT模板，後續篩選則可進一步選擇9-15bp的PBS及10-15bp的RT模板。

研究者還藉助於Tree SHAP算法，對pegRNAs的1766種特徵與PE2編輯效率的相關性進行了系統評估。結果顯示DeepSpCas9分數，即SpCas9活性對PE2編輯效率影響最大。緊隨其後的是PBS中GC鹼基數目，這可歸因於GC數目增加導致的PBS與靶DNA鏈3』末端結合力的增加。研究指出，GC含量低於40%時，PBS的推薦長度為15bp；若GC含量高於60%，PBS推薦長度為9bp。此外，其它影響PE2效率的因素還有PBS序列的Tm值，PBS-RT模板中UU的數目，RT模板對應的目標DNA域的Tm值，靶位點16位的鹼基T等等（圖2）。

圖2 PE2編輯效率的影響因素

之後，為評估不同鹼基編輯類型及編輯位點對PE2效率的影響，研究者設計並構建出包含6800組pegRNA與靶位點的慢病毒新文庫。結果顯示，就編輯效率而言，鹼基插入≥鹼基缺失≥鹼基替換；就鹼基插入而言，1bp與2bp的鹼基插入效率相似，但5bp鹼基插入效率明顯降低，而10bp的鹼基插入效率更低。就鹼基刪除而言，1bp、2bp和5bp的鹼基刪除效率相似，但10bp鹼基刪除效率明顯降低。就鹼基替換而言，C-T替換效率最高，而T-G替換效率最低。就編輯位點而言，+5和+6位點處編輯效率最高而+3位點處編輯效率最低（+1為距離Cas9切口處1bp），其中+5和+6對應於PAM的GG位點，這與早前研究一致，表明針對PAM位點的編輯有助於PE2效率的提高。

最後，在以上分析的基礎上，研究者通過深度學習和隨機森林算法，開發出三種計算模型DeepPE、PE_type和PE_position以及在線工具http://deepcrispr.info/DeepPE，用於pegRNA的設計和效率預測。

總體而言，本研究系統性評估了各因素對引導編輯工具編輯效率的影響，在此基礎上開發的計算模型和在線工具大大加速了pegRNA的設計和篩選，這對引導編輯的優化和未來應用有重要的指導意義。

原文連結

https://doi.org/10.1038/s41587-020-0677-y

製版人：琪醬

參考文獻

1.Anzalone, A. V. et al.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature 576, 149–157 (2019)

2.Rees, H.A. & Liu,D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome ofliving cells.Nat Rev Genet (2018).