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中國環保在線 技術前沿】在冬季低溫影響下，汙
水處理廠氮汙染物去除效果也容易出現反覆。硫自養反硝化法以運行成本低、效率高、工藝簡單等特性受關注，尤其是在低溫低碳氮比條件下的應用更是突出。本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養反硝化反應器為研究對象，進行詳細數據記錄。
汙水低溫脫氮：硫自養反硝化法效果顯著
由於冬季低溫的影響，中國北方汙水處理廠常面臨季節性TN超標的問題。此外，受制於市政汙水低碳氮比的水質特性，汙水處理廠也面臨著異養反硝化不充分而導致的TN超標問題。與異養反硝化相比，硫自養反硝化是以還原態硫為電子供體，NO3--N為電子受體進行的自養反硝化過程，能夠有效地去除水中的NO3--N.硫自養反硝化因無需外加碳源、運行成本低、汙泥產量少、效率高、工藝簡單等優點而得到廣泛關注。目前，Li等將硫自養反硝化工藝應用於低溫、低碳氮比條件下汙水處理廠氮汙染物的去除，並達到了90%以上的氮去除效果。另一方面，硫自養反硝化過程作為冬季或低碳比條件下的脫氮保障工藝，常面臨季節性、間歇性運行的操作方式。但是針對硫自養反硝化工藝飢餓忍耐後能力恢復及其對微生物菌群結構影響的研究卻鮮見報導。
近年來，分子生物學作為有效手段用來研究汙水處理過程中微生物群落結構特性，如變形梯度凝膠電泳、克隆文庫和高通量測序等。MiSeq高通量測序以Illumina的測序技術為基礎，通過可逆終止試劑方法對數百萬個基因片段同時進行大規模平行測序，具有分析結果、高速等特點，被廣泛應用於汙水處理過程中微生物結構和多樣性研究。
本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養反硝化反應器為研究對象，探究反應器在經過30 d飢餓忍耐後的恢復情況，並利用MiSeq高通量測序對飢餓忍耐前後反應器中細菌群落的變化情況進行分析，以期為汙水處理廠脫氮保障工藝的季節性、間歇性運行提供技術參考。
1 材料與方法
1.1試驗裝置
硫自養反硝化工藝採用降流式生物濾池，試驗裝置示意圖如圖 1所示。反應器為密封的有機玻璃柱，內徑140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容積5.94 L.進水口距柱底600 mm，沿反應器不同高度處分別設置取填料口，取填料口距填料頂部的距離分別是100 mm和300 mm。
圖 1 試驗裝置示意
試驗共設2個反應器(分別記為1號、2號)，1號反應器加入硫磺和白雲石的混合物，2號反應器加入黃鐵礦和白雲石的混合物。 2個反應器中的填料均按1:1的體積比混合裝填，硫磺、黃鐵礦和白雲石的粒徑均為5——10 mm.其中，硫磺/白雲石的填充區域孔隙率為45.9%，黃鐵礦/白雲石為44.1%。
1.2 進水水質和接種汙泥
本試驗用水為人工模擬汙水廠尾水，水質指標為： NO3--N濃度為30 mg˙L-1，NH4+-N濃度為2 mg˙L-1，TP濃度為1 mg˙L-1，COD濃度為18——23 mg˙L-1，pH為6.8——7.2.接種汙泥取自高碑店汙水處理廠二沉池回流汙泥。
1.3 反應器運行方式
反應器在低溫下運行85 d (1月2日至3月26日)，主要分為穩定期、飢餓期和恢復期：穩定期(1——30 d)，正常進水，反應器穩定運行，平均溫度為12℃；飢餓期(31——60 d)，停止進水，反應器處於飢餓狀態，平均溫度12.8℃；恢復期(61——85 d)，恢復進水，反應器進入恢復期，平均溫度為14℃。飢餓期結束後及恢復期採集反應器中的汙泥樣品(1號飢餓期A1、恢復期A2；2號飢餓期B1、恢復期B2) 進行MiSeq高通量測序分析，分析反應器飢餓期及穩定期細菌群落的變化情況。
1.4 測試指標和方法1.4.1 水質指標的測定
反應器運行期間，定期採樣進行水質指標的測定，檢測項目包括硝酸鹽氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)、總氮(TN)、總磷(TP) 等。其中NO3--N採用紫外分光光度法測定；NO2--N採用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定；TN採用鹼性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定；TP採用鉬酸鹽分光光度測定。試驗所用
分光光度計為HACH DR5000紫外可見分光
光度計。生物量採用脂磷法測定。
1.4.2 微生物多樣性的測定
DNA的提取與PCR的擴增：為了探究系統的細菌群落，在反應的飢餓期和恢復期進行取樣。採用E. Z. N. A. Soil DNA試劑盒(美國Omega公司)，按照試劑盒說明書提供的操作步驟提取。提取的DNA用1%瓊脂凝膠電泳進行檢測。 PCR的擴增區域為16S rRNA的V3-V4區，細菌16S rRNA擴增引物採用通用引物(338F/806R)。引物名稱和引物序列分別是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。 PCR反應體系： Forward primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；Reverse primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；dNTPs (2.5 mmol˙L-1)，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U˙μL-1)，0.3 μL；補充ddH2O至50 μL.反應程序：先95℃預熱5 min；然後進行25個循環(95℃變形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，後72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司) 回收PCR產物，經Tris-HCl洗脫後，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據電泳結果。將PCR產物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 進行定量，按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合。
MiSeq文庫構建與測序：用高通量測序平臺Illumina MiSeq對擴增產物進行MiSeq高通量測序。測序得到的PE reads根據overlap關係進行拼接，同時過濾掉低質量的reads，區別樣品後進行OUT聚類分析和物種分類學分析。
生物多樣性和分類學分析：首先將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元(OTU)。按照97%相似性進行OUT聚類，採用RDP classifier對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析。利用MOTHUR軟體對樣品覆蓋率(coverage percentage)，ACE，Chao豐富指數以及Shannon多樣性指數進行計算。同時為了保證分析的高可信度，根據SILVA106庫中的參考序列對OUT進行種屬鑑定，種屬比對的可信度閾值設定為80%.
2 結果與討論
2.1反應器運行情況
穩定期、飢餓期和恢復期的硫自養1號和2號反應器進出水水質的變化情況如圖 2所示。進水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均濃度分別為30.00、0.01、35.88和1.00 mg˙L-1.穩定期，反應器在低溫下(12℃) 運行30 d後，1號反應器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為1.78、0.03、2.87和0.91 mg˙L-1，TN去除率為91.9%，1號反應器具有較高的脫氮效果。 2號反應器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為11.32、0.11、13.10和0.14 mg˙L-1，TN和TP去除率分別為63.49%和86.41%. 2號反應器具有同步脫氮除磷的效果。
圖 2 飢餓前後反應器NO3--N、NO2--N、TN、TP的變化
反應器穩定運行後，停止進水，進入飢餓期。經過30 d的飢餓忍耐後，反應器在低溫下(14℃) 恢復進水，進入恢復期。由圖 2可以看出，飢餓忍耐後，1號反應器出水NO3--N增加到27.87 mg˙L-1，2號反應器出水NO3--N增加到26.56 mg˙L-1.但隨著反應器的恢復，出水NO3--N濃度逐漸降低，1號反應器經5 d的恢復(第65 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為0.38 mg˙L-1和2.37 mg˙L-1，去除率分別為98.8%和93.6%；2號反應器經11 d的恢復(第71 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為10.51 mg˙L-1和12.91 mg˙L-1，去除率為66.40%和65.57%.其次，在恢復期2個反應器的出水NO2--N濃度均呈現先增加後降低的趨勢，恢復初期均出現NO2--N的積累。由圖 2可知，1號反應器恢復期第3 d (第63 d) 出水NO2--N濃度為2.17 mg˙L-1；2號反應器恢復期第5 d(第65 d)，出水NO2--N濃度為0.37 mg˙L-1.隨著反應器穩定運行，終1號反應器NO2--N濃度下降到0.1 mg˙L-1以下，2號反應器有0.1 mg˙L-1 NO2--N的積累量。此外，飢餓忍耐未對2號反應器TP的去除效果產生明顯的影響。原因如下，2號反應器對磷的去除主要是通過黃鐵礦中的鐵與磷結合形成鐵磷沉澱物及鐵的氧化物和氫氧化物對磷有吸附作用，飢餓條件下並未明顯影響這一物理化學過程。結果表明，與1號反應器相比，2號反應器的恢復時間略長，但2個反應器都能在低溫、短期內恢復到正常處理效果。
飢餓期(第60 d) 及恢復期(第85 d) 反應器不同高度處微生物量的變化如表 1所示。從中可知，1號和2號反應器飢餓忍耐後不同高度處微生物量均低於恢復期。分析原因，主要是飢餓期間反應器中部分微生物對飢餓環境的忍耐能力差，裂解死亡；部分細菌因營養物質缺乏而進入休眠狀態，不能進行生長繁殖。反應器恢復進水後，生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復，使得微生物量有所增加，同時反硝化性能得以恢復。
表 1 飢餓忍耐前後反應器不同高度處生物量的變化/nmol˙g