深度解讀:2020年諾貝爾化學獎授予CRISPR-CAS9基因編輯技術

2020年10月7日訊/生物谷BIOON/---2020年10月7日，瑞典皇家科學院已決定將2020年諾貝爾化學獎授予德國馬克斯·普朗克病原學研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美國加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士，以表彰她們在基因組編輯領域的貢獻。

（圖片來源：NobelPrize.org）

關於兩位科學家

Emmanuelle Charpentier，1968年出生於法國奧爾維河畔尤維斯。1995年獲得法國巴黎巴斯德研究所博士學位，目前為馬克斯·普朗克病原學研究室主任。Jennifer A.Doudna，1964年生於美國華盛頓特區。博士1989年畢業於美國波士頓哈佛醫學院。美國加州大學伯克利分校教授，霍華德·休斯醫學研究所研究員。

2002年， Emmanuelle Charpentier在維也納大學成立自己的研究小組時，她專注於對人類造成最大影響的病原體之一：化膿性鏈球菌。每年，化膿性鏈球菌感染數以百萬計的人，常見症狀包括扁桃體炎和膿皰在內，往往容易治癒。但是，它也可能破壞體內的軟組織，並且導致危及生命的敗血症的發生。為了更好地了解化膿性鏈球菌，Charpentier希望徹底研究這種細菌的基因是如何進行調控的。這項決定成為了基因編輯技術的起點。

2006年，Jennifer Doudna博士領導的加州大學伯克利分校研究小組正致力於 「RNA幹擾」 現象的研究。多年以來，研究人員一直認為他們已經掌握了RNA的基本功能，但此後突然發現了許多新型的小RNA分子，它們有助於調節細胞中的基因活性。

細菌的古老的「免疫系統」

Doudna博士的同事，一名微生物學家，無意間向Doudna講述了一項新發現：當研究人員比較差異極大的細菌以及古細菌的遺傳物質時，他們發現其中的DNA重複序列保存得非常好。相同的代碼一遍又一遍地出現，但是其中又有不同的序列。就像在書中的每個句子之間重複相同的單詞一樣。

(圖片來源：NobelPrize.org)

這些重複序列稱為「成簇的規則間隔的短回文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）」，縮寫為CRISPR。由於CRISPR中獨特的非重複的序列似乎與各種病毒的遺傳密碼相匹配，因此研究者們認為這是細菌的古老免疫系統的一部分，可以保護細菌和古細菌免受病毒侵害。如果細菌成功地抵抗了病毒感染，它會將一部分病毒的遺傳密碼添加到其基因組中，作為對感染的記憶。

雖然還沒有人知道其中的分子機制，但當前的基本假設是：細菌通過RNA幹擾的機制達到中和病毒的目的。

複雜的分子機製圖譜

如果細菌被證明確實存在古老的免疫系統，那麼將會成為科學界很重要的發現，為此Doudna博士的好奇心開始生起，並且開始學習有關CRISPR系統的一切知識。

（圖片來源：NobelPrize.org）

事實證明，除CRISPR序列外，細菌內部還存在一種被稱為CRISPR相關，縮寫為cas的特殊基因。Doudna博士發現這些基因與編碼專門用於解鏈和切割DNA的蛋白質的基因非常相似。那麼Cas蛋白是否具有相同的功能，它們能否切割病毒DNA就成為了新的問題。

幾年後，Doudna博士領導的研究小組成功地揭示了幾種不同的Cas蛋白的功能。同時，該系統也陸續被其它研究小組發現。細菌的免疫系統可以採取非常不同的形式。下圖展示了不同類型的 CRISPR / Cas系統工作機制。Doudna博士所研究的CRISPR / Cas系統屬於1類；這是一個複雜的機制，需要許多不同的Cas蛋白來清除病毒。第2類系統非常簡單，因為它們需要的蛋白質更少。在世界的另一邊， Emmanuelle Charpentier博士剛剛遇到了這樣的系統。

CRISPR系統的難題

Emmanuelle Charpentier早期居住在維也納，但在2009年，她移居到瑞典北部的Umeå大學，擁有良好的研究機會。很多人建議她不要偏遠的地方，但是她認為Umeå大學當地漫長而黑暗的冬天讓她有長期的平靜生活，這對於開展科學研究是十分重要的。

在病原微生物研究工作的同時，Charpentier對參與基因調控的小RNA分子感興趣。通過與柏林的研究人員合作，Charpentier等人化膿性鏈球菌內部的小RNA進行了定位。這種細菌中大量存在的小RNA分子之一此前並未被報導，並且其遺傳密碼非常接近於基因組中的CRISPR序列。

通過仔細分析它們的遺傳密碼，Charpentier發現這一新型的小RNA分子的一部分與CRISPR基因中的重複序列存在部分匹配。

雖然此前Charpentier從未接觸過CRISPR系統。但她的研究小組通過一系列徹底的微生物學檢測工作，對化膿性鏈球菌中的CRISPR系統進行定位。根據目前的研究，已知該系統屬於2類，即僅需一個Cas蛋白Cas9即可達到靶向裂解病毒DNA的目的。Charpentier的研究同時表明，未知的RNA分子（稱為反式激活的crisp RNA（tracrRNA））對於CRISPR的功能實現具有決定性的意義。它可以幫助基因組中的CRISPR序列轉錄產生的長RNA分子加工為成熟的，具有活性的形式。

經過深入而有針對性的實驗後， Charpentier博士在2011年3月發表了其關於tracrRNA的發現。儘管她在微生物學方面擁有多年經驗，但是在繼續研究CRISPR-Cas9系統方面，她希望與更加專業的科學家合作。Jennifer Doudna博士因此成為了自然的選擇。Charpentier被邀請參加在波多黎各舉行的一次會議時，兩位科學家進行了一次歷史性的會面。

波多黎各的咖啡館裡的會談改變了「生命」

會議的第二天，她們經同事介紹在一家咖啡館見面。第二天， Charpentier邀請Doudna博士等人在波多黎各的舊城區遊玩，順便深入交流彼此的研究。Charpentier想知道Doudna是否對這一合作感興趣，是否想研究化膿性鏈球菌的基因編輯系統。

Jennifer Doudna對此很感興趣，他們和他們的同事們通過數字會議為該項目制定了計劃。他們猜測細菌需要CRISPR-RNA來識別病毒的DNA序列，而Cas9則是最終切斷DNA分子的剪刀。但是，當他們在體外進行測試時，卻沒有得到預期的結果。

經過大量的頭腦風暴和大量失敗的實驗之後，研究人員終於將tracrRNA添加到他們的系統中。此前，他們認為只有在將CRISPR-RNA切割成其活性形式時才需要tracrRNA（圖2）。當Cas9獲得tracrRNA時，每個人都在等待的結果終於發生了：DNA分子被切割成兩部分。

劃時代的實驗

研究人員決定嘗試對「遺傳剪刀」進行簡化。利用他們對tracr-RNA和CRISPR-RNA的新見解，他們成功地將兩者融合為一個分子，並將其命名為「Guide RNA」。使用這種遺傳剪刀的簡化版本，他們進行了一項劃時代的實驗：是否可以控制這種遺傳工具，以便在任意位置切割DNA。

到此時，研究人員知道他們已經十分接近目的。他們從Doudna博士實驗室的冰箱中獲得了一個基因，並選擇了五個可以切割的部位。然後，他們改變剪刀的CRISPR部分，以使其代碼與要進行切割的部位的序列相匹配。結果表明， DNA分子能夠在正確的位置被切割。

基因剪刀改變了生命科學

在Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna在2012年發現CRISPR / Cas9基因剪刀後不久，其它幾個研究小組證明該工具可用於修飾小鼠和人類細胞的基因組，從而導致其爆炸性的發展。此前，改變細胞，植物或生物體中的基因是一項非常耗時，有時甚至是不可能的完成的工作。使用CRISPR基因編輯工具，研究人員原則上可以在他們想要的任何基因組中進行切割。此後，很容易利用細胞的天然系統對DNA進行修復，從而實現基因的「重定義」。

（圖片來源：NobelPrize.org）

由於這種基因工具非常易於使用，因此在基礎研究中得到了廣泛的應用。例如它可以用於改變細胞和實驗動物的DNA，以了解不同基因如何起作用和相互作用。

基因剪刀也已成為植物育種的標準工具。研究人員以前用來修飾植物基因組的方法通常需要添加抗生素抗性基因。種植農作物時，存在這種抗藥性擴散到周圍微生物的風險。由於有了遺傳剪刀，研究人員不再需要使用這些舊方法，而是可以對基因組進行非常精確的修飾。他們編輯了使水稻從土壤吸收重金屬的基因，從而改良了水稻，使鎘和砷含量降低。研究人員還開發出了能夠在溫暖的氣候下更好地抵抗乾旱，抵抗昆蟲和害蟲的作物。

在醫學上，基因剪刀為癌症的新免疫療法做出了貢獻，正在進行使夢想成真的試驗-治療遺傳性疾病。研究人員已經在進行臨床試驗，以研究他們是否可以使用CRISPR / Cas9來治療鐮狀細胞性貧血和β地中海貧血等血液疾病以及遺傳性眼病。

他們還在開發修復大腦和肌肉等大型器官中基因的方法。動物實驗表明，經過特殊設計的病毒可以將遺傳剪刀傳遞給所需的細胞，從而治療毀滅性遺傳疾病的模型，例如肌肉營養不良，脊髓性肌肉萎縮和亨廷頓舞蹈病。但是，該技術需要進一步完善，才能在人體上進行測試。

「基因剪刀」的力量需要監管

除了其所有優點之外，遺傳剪刀也可能存在被濫用的風險。例如，該工具可用於創建轉基因胚胎。但是，多年來，有控制基因工程應用的法律和法規，其中包括禁止以允許遺傳改變的方式修改人類基因組。另外，涉及人畜的實驗必須在進行倫理委員會之前進行審查和批准。

可以肯定的是：這些遺傳剪刀影響著我們所有人。我們將面臨新的道德問題，但是這種新工具可能有助於解決人類目前面臨的許多挑戰。通過Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna的新發現，生命科學成功進入了一個新時代。當我們具有了此前不曾擁有過的強大能力後，將在未來探索生命科學「新大陸」時做出更多偉大的發現。（生物谷 Bioon.com）