在細胞實驗中經常會遇到對細胞的增殖檢測和毒性檢測，以往常用MTT試劑盒進行檢測。CCK-8試劑盒出現後，由於其更加簡單便捷的操作和更加靈敏優越的檢測效果引起了廣泛的好評。但是似乎還有很多人對CCK-8試劑盒不是很了解，AbMole收到了很多小夥伴對於CCK-8試劑盒的提問，那我們今天就一起來聊聊關於CCK-8試劑盒的那些事兒吧。
產品簡介
CCK-8試劑盒是Cell Counting Kit的簡稱，是一種廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。其基本原理是：該試劑中含有WST-8（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），WST-8屬於MTT的升級產品，在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臢產物(Formazan)，反應機制如下圖所示。生成的甲臢物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。即生成甲臢顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。
WST-8檢測原理圖
CCK-8法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。
產品優點相比較於以往的細胞增殖/毒性檢測試劑，CCK-8優點在於：
使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；
CCK-8法能快速檢測；
CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；CCK-8法的重複性優於MTT 法；
CCK-8法對細胞毒性小；
CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預製，即開即用。
具體區別見下表：
使用說明
CCK-8使用其使用方法在增殖和毒性試驗中有所區別：細胞增殖試驗：
1. 接種細胞懸液100 l (2000個/孔)於96孔板，預先置於37℃，5% CO2飽和溼度的培養箱內培養。
2. 加入10μL CCK-8，由於每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻，同時要注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數。
3. 把培養板放培養箱內1-4小時。由於細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
4. 測定450nm吸光度，建議採用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
細胞毒性試驗：
1. 接種細胞懸液100 l (5000個/孔)於96孔板，預先置於37℃，5% CO2飽和溼度的培養箱內培養。
2. 加入不同濃度的毒性物質。
3. 37℃培養箱中培養，加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。
4. 加入10ul CCK-8，由於每孔加入CCK-8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻，同時要注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數。
5. 把培養板放培養箱內1-4小時。由於細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
6. 測定450nm吸光度，建議採用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
注意事項
1由於使用96孔板進行檢測，如果細胞培養時間較長，一定要注意蒸發問題。一方面，由於96孔板周圍一圈最容易蒸發，可以採取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、 水或培養液；另一方面，可以把96孔板置於靠近培養箱內水源的地方，以緩解蒸發。
2本試劑盒的檢測依賴於脫氫酶催化的反應， 所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。3如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基（除去培養基，並用培養基洗滌細胞兩次，然後加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可。
4用酶標儀檢測前需確保每個孔內沒有氣泡，否則會干擾測定。
活力計算
細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0 加藥)-A(空白)] ×100
A(加藥)：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培養基和CCK-8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度
A(0 加藥)：具有細胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力
除了以上這些，AbMole還有一些Tip送給大家：
培養板的選擇
除96孔板外，24孔板、12孔板均可用於CCK-8檢測，只是採用24孔板、12孔板CCK-8的用量較多，使用量仍為培養基體積的1/10。
減少CCK-8加樣的誤差避免CCK-8在槍頭和孔壁上的殘留；
可在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑並混勻後加樣。
製作標準曲線的方法
取已知細胞數量的細胞懸液加入到培養板中；
用培養基依次等比例稀釋成一個系列濃度的細胞懸液；
細胞培養一段時間後加入CCK-8試劑孵育1-4小時；
酶標儀進行測定，以細胞數量為X軸，OD值為Y軸，就可以製作標準曲線。
CCK-8加入後最佳的檢測時間
CCK-8試劑和細胞內的脫氫酶反應是一個循環反應，隨著時間的增加，顏色不斷加深，OD值也會不斷增加，但細胞數量卻沒有變化；
一般情況下，建議在確定最佳的實驗條件（合適的時間、合適的OD值）後，把加入CCK-8試劑後的培養時間固定下來，以後在同樣的培養時間點進行檢測。
終止CCK-8顯色的幾種方法（96孔板）
每孔加入10μl 0.1M HCl溶液；
在顯色反應後，將培養板放入4度冰箱內；
每孔加10μl 1%（W/V）的SDS溶液；
註：反應停止後，應在24小時內測定。