獲獎論文一等獎：紫蘇肽對免疫低下小鼠免疫功能的影響
朱豔 魏穎, 王雨辰 姜盛 郭穎 蔡木易 谷瑞增
（1. 中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2. 華狐生物科技（中國）有限公司,遼寧 110000）
摘要 目的 探究紫蘇肽對免疫低下小鼠免疫系統的調節作用。方法 採用腹腔注射環磷醯胺（CXT）建立免疫力低下小鼠模型，通過灌胃低、中、高劑量的紫蘇肽，檢測紫蘇肽對免疫低下小鼠T/B淋巴細胞的增殖、NK細胞殺傷力、血清溶血素產生量、巨噬細胞吞噬活性以及血清中細胞因子IL-2和IgG含量的影響。結果 紫蘇肽能夠增加免疫低下小鼠T/B淋巴細胞增殖能力、NK細胞殺傷力、血清溶血素含量、巨噬細胞吞噬能力以及血清細胞因子的含量，並呈現一定的濃度依賴，高劑量的紫蘇肽效果最好。結論 紫蘇肽對免疫力低下小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫均具有一定的調節作用。
朱 豔
關鍵詞：紫蘇肽；免疫調節；環磷醯胺；細胞免疫；體液免疫；非特異性免疫
紫蘇是一種重要的經濟作物，在我國已經有2000多年的種植歷史[1]。它是典型的藥食同源植物，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抗腫瘤等藥理功能[2]。2002年中華人民共和國衛生部將紫蘇及其種子列入87種藥食兩用植物種，充分證明了其食用和藥用價值[3]。紫蘇籽油脂含量豐富，高達45﹪，常用於製備紫蘇油。紫蘇籽提油後剩餘的紫蘇籽粕中蛋白質含量豐富，約為30~45﹪，胺基酸種類齊全，含有8種人體必需胺基酸且必需胺基酸含量與雞蛋相當，屬於優質蛋白[4,5]。但目前紫蘇籽粕大部分用作廉價的動物飼料，造成了資源的浪費。
免疫是指機體為了維護自身穩定，排除異己並維持機體穩定性的一種生理機能[6]。免疫系統對於防禦病原體是至關重要的，但是免疫系統又會受到壓力、不健康的生活習慣、病原體等多種因素的影響，從而引起免疫力低下。免疫力降低不僅增加一些傳染病的感染概率，還會增加許多非傳染病如衰老、癌症、心血管疾病、抑鬱症等的患病機率，嚴重影響人們的健康生活[7,8,9]。植物蛋白酶解產生的活性肽，它們比蛋白質更容易被人體吸收，且具有更廣泛的生理功能，在抗氧化、增強免疫力等方面做出了巨大的貢獻[10,11,12]。目前有研究學者對紫蘇粕中蛋白質進行酶解，得到具有很強抗氧化活性的多肽，DPPH清除率達到了73.64﹪[2]；賀東亮[13]酶解紫蘇蛋白通過超濾分離得到一個七肽能夠抑制腫瘤細胞的增殖並促進凋亡，具有較強的抗腫瘤活性。因此，紫蘇肽可能具有更強的免疫調節活性。
基於此，我們以本實驗室自製的紫蘇肽為實驗對象，以環磷醯胺（CXT）建立免疫低下小鼠模型，探究紫蘇肽的免疫調節作用，為相關食品和保健品的開發奠定基礎。
1. 材料與方法
1.1 材料與儀器
Balb/c 6-8周雌性小鼠（許可證：SCXK（京）2016-0006）：北京維通利華實驗動物技術有限公司；紫蘇肽：實驗室自製；環磷醯胺：江蘇盛迪醫藥有限公司；左旋咪唑、0.33﹪中性紅染色液、0.4﹪臺盼藍、補體、15﹪綿陽紅細胞（SRBC）：北京索萊寶生物技術有限公司；小鼠淋巴瘤細胞（YAC-1）：上海冠導生物工程有限公司；CCK-8、紅細胞裂解液：碧雲天生物技術有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清（FBS）：Hyclon公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白（ConA）：Sigma Aldrich公司；TNF-α、IL-2酶聯免疫檢測試劑盒：北京百智生物科技有限公司。
BD C6流式細胞儀：美國Thermofisher公司；Spectra MR多功能酶標儀：美國Dynex公司；721型紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。
1.2 動物飼養與分組
54隻健康雌性Balb/c小鼠，體重18~22 g。適應性餵養3 d後，隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（左旋咪唑，灌胃劑量30 mg/kg）、紫蘇肽低、中、高劑量組，每組6隻，分籠飼養。紫蘇肽的成人推薦攝入量為3 g/60 kg，實驗中採用人推薦劑量的0.5、1、2倍分別作為紫蘇肽灌胃的高（1.2 g/kg）、中(0.6 g/kg)、低(0.3 g/kg)劑量。每天灌胃一次，連續28 d。
1.3 實驗內容
1.3.1 免疫力低下小鼠模型的建立
空白組小鼠腹腔注射0.2 mL的生理鹽水，其餘各組腹腔注射40 mg/kg的CXT，每天1次，連續3 d，此後每隔7 d按照劑量為80 mg/kg腹腔注射一次進行加強。在造模過程中每天依然灌胃紫蘇肽，灌胃28 d後，小鼠斷食不斷水12 h後，處死小鼠，進行指標的檢測。
1.3.2 紫蘇肽對小鼠臟器指數的測定
小鼠灌胃28 d後，斷食不斷水12 h，稱重，解剖取其胸腺和脾臟，計算胸腺指數和脾臟指數：
1.3.3 紫蘇肽對小鼠T/B淋巴細胞增殖能力的影響
小鼠灌胃28 d後，斷食不斷水12 h，拉頸處死，在75﹪酒精中浸泡5 min後取出，無菌狀態下取其脾臟，研磨，過200目尼龍篩，並用PBS衝洗，收集濾液，向其中加入2 mL紅細胞裂解液，靜置2~3 min，使紅細胞裂解，3500 r/min離心2 min，棄上清， PBS清洗2次，將沉澱重懸於RPMI-1640完全培養基中，即為脾細胞懸液。用臺盼藍進行染色，細胞活性大於95﹪方可用於實驗。用RPMI-1640完全培養基調整細胞濃度為5ⅹ106個/mL接種於96孔板中，每孔90 µL，每組6個復孔，再向每孔添加10 µL的ConA或LPS（終濃度為15 µg/mL），分別用於脾細胞向T/B淋巴細胞的轉化，將接種好的96孔板置於培養箱中孵育72 h，再向每孔加入10 µL CCK-8，孵育2 h，於酶標儀490 nm處測定吸光度值。
1.3.4 紫蘇肽對小鼠NK細胞殺傷力的影響
用RPMI-1640完全培養基調整脾細胞濃度為5ⅹ106個/mL作為效應細胞。YAC-1細胞用RPMI-1640完全培養基培養，待細胞生長為對數期，用臺盼藍染色確定細胞活性大於95﹪即可用於實驗。調整細胞濃度為1ⅹ105個/mL作為靶細胞，保證效靶比為50：1，向U型96孔板每孔添加100 µL的效應細胞和100 µL的靶細胞，每組6個復孔，設置靶細胞對照孔和效應細胞對照孔，靶細胞對照孔中加入100 µL靶細胞懸液和100 µL完全培養基，效應細胞對照孔中加入100 µL效應細胞懸液和100 µL完全培養基，於培養箱中孵育4 h，再向每孔添加10 µL CCK-8，繼續孵育2 h，於酶標儀490 nm處測定吸光度值。
1.3.5 紫蘇肽對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響
小鼠灌胃25 d後，每組取3隻小鼠腹腔注射1 mL 6﹪澱粉肉湯溶液，誘導產生巨噬細胞。灌胃28 d後，小鼠斷食不斷水12 h，拉頸處死並在75﹪酒精中浸泡5 min，隨後在無菌工作檯上剝離腹部皮膚，注意不要弄破腹腔膜，用無菌注射器向小鼠腹部注射3 mL PBS，輕柔腹腔膜，收集腹腔液，3500 r/min離心3 min，收集沉澱，並用PBS離心清洗2次，最後將細胞重懸於RPMI-1640完全培養基中，即為巨噬細胞懸液。用臺盼藍對進行染色確定細胞活性大於95﹪即可用於實驗。將細胞接種在細胞培養瓶中，在培養箱中培養2 h使其貼壁，棄掉未貼壁的細胞，收集貼壁細胞，調整細胞濃度為5ⅹ106個/mL，接種於96孔板，每孔100 µL，每組6個復孔，在培養箱中24 h使其貼壁，再每孔加入100 µL 0.1﹪中性紅溶液，繼續培養1 h，用PBS洗去培養液中的中性紅，每孔加入100 µL細胞裂解液(含體積分數1﹪的乙酸和50﹪的乙醇)，室溫放置2-3 h，細胞溶解後，用酶標儀測定559 nm處吸光度值，空白組為灌胃生理鹽水小鼠腹腔巨噬細胞。
1.3.5 紫蘇肽對小鼠血清血溶素含量的影響
每組取3隻小鼠，灌胃24 d後，腹腔注射0.2 mL 5﹪ SRBC誘導產生過敏反應，灌胃28 d後，對小鼠進行眼角採血，分離血清。用生理鹽水將血清稀釋200倍，取血清樣品1 mL、10﹪ SRBC 0.5 mL、1 mL補體於試管中，對照孔用生理鹽水代替血清，37℃水浴加入30 min，冰浴終止反應，離心取上清，用紫外分光光度計測定540 nm處吸光度值。結果用OD值表示。
1.3.6 紫蘇肽對小鼠血清細胞因子IgG、IL-2的影響
小鼠灌胃28 d後，斷食不斷水12 h，摘眼球採血，分離血清，用IgG和IL-2酶聯免疫試劑盒測定血清中二者的含量。
2. 實驗結果
2.1 紫蘇肽對免疫器官的影響
小鼠注射CXT後脾臟指數和胸腺指數均發生降低，說明免疫低下小鼠模型建立成功。紫蘇肽能夠減輕CXT引起的免疫器官衰減現象，並且隨著紫蘇肽灌胃濃度升高，小鼠免疫器官衰減量減少，高劑量的紫蘇肽效果與陽性藥物可媲美。
圖1 紫蘇肽對免疫低下小鼠免疫器官的影響
Fig. 1 Effect of Perilla peptides on immune organs in immunocompromised mice
2.2 紫蘇肽對T/B淋巴細胞增殖能力的影響
如圖2所示，模型組小鼠體內T/B淋巴細胞的增殖能力顯著降低（P＜0.01），與模型組相比，小鼠灌胃紫蘇肽後，T/B淋巴細胞的增殖能力均發生不同程度的提高，低劑量的紫蘇肽並不能顯著增加模型組小鼠脾淋巴細胞的增殖能力，隨著灌胃劑量的增加，效果增強，高劑量的紫蘇肽極其顯著地（P＜0.01）增加了免疫低下小鼠T/B淋巴細胞的增殖能力。
圖2 紫蘇肽對免疫力低下小鼠T/B淋巴細胞增殖的影響
Fig. 2 Effect of Perilla on T/B lymphocyte proliferation in immunocompromised mice
註：* P＜0.05，** P＜0.01，與空白組比；# P＜0.05，## P＜0.01，與模型組比
2.3 紫蘇肽對NK細胞殺傷力的影響
圖3反映了紫蘇肽對免疫力低下小鼠NK細胞殺傷力的影響。免疫力低下小鼠NK細胞殺傷力與正常組小鼠相比顯著降低（P＜0.01），可見CXT誘導小鼠的特異性免疫受到損傷，紫蘇肽能夠通過增加NK細胞殺傷力而緩解CXT引起的免疫損傷，並呈現一定的劑效關係，低劑量和中劑量的紫蘇肽顯著（P＜0.05）增加了免疫力低下小鼠的NK細胞殺傷力，而高劑量的紫蘇肽則極為顯著(P＜0.01)地增肌了小鼠的NK細胞殺傷力。
圖3 紫蘇肽對免疫力低下小鼠NK細胞殺傷力的影響
Fig. 3 Effects of Perilla peptides on NK cell lethality in immunocompromised mice
註：* P＜0.05，** P＜0.01，與空白組比；# P＜0.05，## P＜0.01，與模型組比
2.4 紫蘇肽對巨噬細胞吞噬能力的影響
巨噬細胞吞噬能力也是反應細胞非特異性免疫強弱的一個重要指標。如圖4所示，模型組小鼠巨噬細胞吞噬能力與空白組相比顯著降低（P＜0.01），意味著小鼠的非特異性免疫受到破壞。高劑量的紫蘇肽極顯著（P＜0.01）地增加了免疫力低下小鼠體內巨噬細胞吞噬異物的能力，低劑量和中劑量的紫蘇肽雖然也使得小鼠吞噬細胞吞噬異物能力增加，但是與模型組相比並沒有表現出明顯的差異。
圖4 紫蘇肽對免疫力低下小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響
Fig. 4 Effect of Perilla peptides on macrophage phagocytosis in immunocompromised mice
註：* P＜0.05，** P＜0.01，與空白組比；# P＜0.05，## P＜0.01，與模型組比
2.5 紫蘇肽對血清溶血素的影響
如圖5所示，與正常組相比，模型組小鼠血清溶血素含量顯著降低（P＜0.01），可見CXT導致小鼠體液免疫受到一定的損傷。紫蘇肽對中劑量的紫蘇肽便能極為顯著地（P＜0.01）增加免疫力低下小鼠血清溶血素含量，高劑量的紫蘇肽的效果更強，因此紫蘇肽能夠起到調節免疫力低下小鼠體液免疫的作用。
圖5 紫蘇肽對免疫力低下小鼠血清溶血素含量的影響
Fig. 5 Effect of Perilla peptides on serum hemolysin content in immunocompromised mice
註：* P＜0.05，** P＜0.01，與空白組比；# P＜0.05，## P＜0.01，與模型組比
2.6 紫蘇肽對IgG、IL-2含量的影響
表1為紫蘇肽對免疫力低下小鼠血清中細胞因子IgG和IL-2含量的影響。結果顯示，模型組小鼠免疫力降低，血清中IgG和IL-2的含量與模型組相比均發生顯著降低，紫蘇肽呈濃度依賴地增加了免疫力低下小鼠血清中IgG和IL-2的含量，其中，與模型組相比，高劑量的紫蘇肽極為顯著地（P＜0.01）增加了免疫低下小鼠血清中IL-2的含量，並顯著（P＜0.05）增加了IgG含量。因此高劑量的紫蘇肽對增強小鼠免疫調節能力效果更強。
表1 紫蘇肽對免疫力低下小鼠血清IgG、IL-2含量的影響
Table. 1 Effects of Perilla peptides on serum IgG and IL-2 levels in immunocompromised mice
分組
IL-2（pg/mL）
IgG（µg/mL）
空白組
0.22±0.018
83.63±4.21
模型組
0.16±0.006*
51.22±2.6**
陽性對照組
0.19±0.019
69.08±3.29##
紫蘇肽低劑量組
0.2±0.013
48.18±3.25
紫蘇肽中劑量組
0.23±0.029#
55.59±2.86
紫蘇肽高劑量組
0.26±0.029##
62.96±3.77#
註：* P＜0.05，** P＜0.01，與空白組比；# P＜0.05，## P＜0.01，與模型組比
3. 結論與討論
胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官，胸腺指數和脾臟指數高低在一定程度上能夠反映機體免疫能力的強弱，常作為動物免疫學機制研究實驗的初步評判指標[14,15]。本實驗結果表明，與模型組相比，紫蘇肽能夠減弱CXT引起的免疫器官衰減，對小鼠免疫系統具有一定的調節作用。
脾臟作為機體重要的免疫器官，含有大量的淋巴細胞，主要包括T淋巴細胞、B淋巴細胞以及NK細胞等，它們增殖能力的高低代表了淋巴細胞功能的強弱[16]。體外培養的淋巴細胞受到非抗原刺激會轉化為母淋巴細胞並活化增殖，ConA和LPS可分別作為T淋巴細胞和B淋巴細胞的非抗原刺激物，誘導T/B淋巴細胞的增殖，介導細胞免疫和體液免疫[17]。淋巴細胞活化會分泌一些高活性的細胞因子，它們是免疫系統的重要組成部分。IL-2是由T淋巴細胞分泌產生的一種細胞因子，能夠促進T、B淋巴細胞的增殖，NK細胞的活化，因此，IL-2在調節機體免疫反應方面具有重要作用，是一種常見的檢測指標[18]。B淋巴細胞活化會產生免疫球蛋白，其中IgG佔80﹪，是反映體液免疫強弱的重要指標[19]。此外，當B淋巴細胞受到抗原（SRBC）刺激時產生溶血素，它的產生量的多少反映了細胞的抗體產生水平，從一定程度上反映了體液免疫的強弱[20]。實驗結果顯示，高劑量的紫蘇肽能顯著（P＜0.01）增加小鼠T/B淋巴細胞的增殖、NK細胞殺傷力以及血清中IgG和IL-2含量，當小鼠受到SRBC刺激後，灌胃高劑量紫蘇肽的小鼠體內溶血素含量明顯升高（P＜0.01），故紫蘇肽具有較強的調節細胞免疫和體液免疫效果。
巨噬細胞是非特異性免疫的重要組成細胞之一，其吞噬功能是衡量機體非特異性免疫的主要標誌[21,22]。本實驗結果表明，紫蘇肽能夠提高免疫力低下小鼠吞噬細胞吞噬中性紅的能力，高劑量的紫蘇肽提高小鼠吞噬細胞吞噬能力的作用與模型組具有顯著差異（P＜0.01）。
綜上所述，高劑量的紫蘇肽對免疫系統多個環節均具能起到較強保護和增強作用，對免疫低下小鼠的細胞免疫、體液免疫和非特異性免疫均能起到良好的調節作用。因此，將其作為增免原料添加入相關的保健品中或者以紫蘇肽為主料，輔以其他原料製備具有增強機體免疫力的紫蘇肽粉，每天按5.8 g/60 kg服用，能夠提高機體免疫力，降低多種疾病的發生概率。
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