Genome Research:精子發生中的lncRNA動態轉錄圖譜

來源 | BioArt

精子發生（Spermatogenesis）是睪丸組織內精密調控的細胞分化過程，主要由有絲分裂、減數分裂和精子形成三個階段組成。在哺乳動物的各類器官發育中，精子發生呈現出最為豐富的轉錄組多樣性，特別是長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）尤其顯著。

據研究報導，lncRNA在多個物種的睪丸組織中均富集程度最高，這一表達格局在不同物種間高度保守，提示lncRNA與精子發生之間存在特殊聯繫。LncRNA是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的RNA分子，通常認為它們幾乎不編碼蛋白質，而是以RNA 的形式與核酸和蛋白質發生廣泛相互作用，在器官發育或細胞分化過程中發揮關鍵的調控功能。

迄今為止，在人類和其它哺乳動物的睪丸基因組中已鑑定發現了大量特異表達的lncRNA，然其在精子發生中的生理功能及作用機制仍不清楚。因此，深入解析lncRNA在精子發生中的動態表達全貌以及開發快速有效的功能性lncRNA篩選策略與哺乳動物研究模型，將有助於進一步發現精子發生中lncRNA的生理功能及作用機理。

近日，中國醫學科學院基礎醫學研究所宋偉團隊和餘佳團隊合作在Genome Research發表了題為：Panoramic transcriptome analysis and functional screening of long noncoding RNAs in mouse spermatogenesis 的研究長文。

本研究全面描繪了lncRNA在小鼠精子發生過程中的動態轉錄組圖譜，聯合快速高效的在體精子發生及功能評價模型篩選出具有潛在調控功能的lncRNA，並在單細胞尺度詳細解析了lncRNA Gm4665在精子形成時期的重要生理功能。

LncRNA研究的重要命題是其時空表達和生理功能。該研究圍繞這兩個方面對精子發生中功能性lncRNA展開詳細解析。研究人員首先從小鼠睪丸中分離6種類型的生精細胞，通過RNA-seq描繪lncRNA在精子發生中的動態轉錄組圖譜，並鑑定出8418個已注釋lncRNA以及523個全新未注釋lncRNA；深入分析發現lncRNA與其鄰近的第一個蛋白編碼基因相關性最強，且兩者的基因組相對位置影響其表達相關性；此外，還鑑定了968個生精細胞特徵性（signature） lncRNA，其中精子變形時期的表達比例最高（佔36.3%）；通過與重要蛋白編碼基因的共定位或共表達分析，對精子發生中動態變化的lncRNA進行了功能注釋，並採取嚴格的篩選標準最終獲得27個潛在的功能性lncRNA。

圖 1 小鼠精子發生過程中lncRNA動態轉錄組圖譜。

由於lncRNA在長度、結構、功能、基因座等方面的複雜性及較低的保守性，體內鑑定功能性lncRNA存在諸多困難。DNA水平缺失（Knockout）是研究功能性生精基因的理想模型，然而該技術並不適合靶向所有類型的lncRNA，整個lncRNA基因座位的缺失可能存在一定的脫靶效應，例如導致基因調控元件或其它功能基因的缺失。

因此，RNA水平缺失（Knockdown）是體內研究功能性lncRNA的另一有效策略。該研究結合改良的腺相關病毒運載系統（AAV）和睪丸網顯微注射技術構建了小鼠在體精子發生及功能評價模型，利用AAV-shRNA介導的基因敲降可在體內水平有效抑制lncRNA表達，通過評估睪丸組織重量、成熟精子數量、曲細精管形態、生精細胞缺失及凋亡等指標快速篩選精子發生中的功能性lncRNA。利用該研究模型篩選發現3個在精子發生中發揮重要生理功能的lncRNA（Gm4665, 1700027A15Rik, 1700052I22Rik）：體內水平敲降後，可造成睪丸組織重量下降及圓形精子和長形精子細胞的數量明顯減少。

圖 2 小鼠在體精子發生及功能評價模型。

隨後，研究人員巧妙聯合在體生精功能研究模型和單細胞轉錄組測序（Single-cell RNA-seq）進一步在單細胞尺度解析lncRNA Gm4665敲降後特定生精細胞群體圓形精子和長形精子轉錄圖譜的變化，發現該lncRNA敲降後導致一系列功能性生精基因（Ip6k1, Akap3, Hook1, Ropn1, Map7）表達下調；擬時序分析（Pseudotime analysis）表明精子發生早期發育正常（SPG，plpSC，pacSC），但是精子發生晚期發育出現異常，主要表現為圓形精子（rST）向長形精子（elST）分化受阻。機制上，通過ChIRP-seq發現lncRNA Gm4665主要富集在功能性生精基因（包括Ip6k1, Akap3及Hook1等）的啟動子活性區域或染色質開放區域，該lncRNA敲降後能夠在轉錄水平抑制功能性生精基因的表達，從而導致圓形精子向長形精子分化異常。

圖 3 單細胞尺度解析lncRNA Gm4665在精子發生中的作用機制。

綜上，該研究系統性描繪了小鼠精子發生過程中lncRNA的動態表達圖譜，並開發了哺乳動物睪丸組織內篩選功能性lncRNA的在體生精功能研究模型，從「系統發現」、「功能篩選」到「機制解析」多個層面闡釋了lncRNA對精子發生的重要性，為lncRNA在雄性生殖發育領域的進一步研究提供了資源（resource）和範式（paradigm）。

中國醫學科學院基礎醫學研究所李凱助理研究員、徐嘉悅博士後和羅豔雲博士為該論文的共同第一作者，宋偉研究員、餘佳研究員和馬豔妮副研究員為該論文共同通訊作者。

論文連結：

https://genome.cshlp.org/content/early/2020/12/16/gr.264333.120.full.pdf+html