數字PCR | 基於EVAGREEN®方法的CRYSTAL數字PCR絕對定量檢測

2020-11-30 儀器信息網

EvaGreen®是一種無致突變性、無細胞毒性的DNA結合染料，NaicaTM Crystal全自動微滴晶片數字PCR儀系統可兼容EvaGreen®染料進行的數字PCR實驗分析。 

反應體系中游離的的EvaGreen®染料不發出螢光信號，但與雙鏈DNA（dsDNA）結合後會發出很強的螢光。NaicaTM Crystal全自動微滴晶片數字PCR儀系統使用檢測參比螢光（螢光素鈉鹽）相同的濾光片可進行EvaGreen®染料螢光信號的檢測。 

使用NaicaTM Crystal全自動微滴晶片數字PCR儀系統，EvaGreen®可以通過使用簡單的引物來實現靶標絕對定量。使用我們的Sapphire晶片、基於EvaGreen®的方法可檢測低至0.2copies/μL。


圖1：基於EvaGreen®染料方法的基因組DNA絕對定量


對未進行片段化的人基因組DNA進行倍比稀釋，濃度範圍從1000-0.2copies/μL，使用NaicaTM Crystal全自動微滴晶片數字PCR儀系統進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen®，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。為了保證重複性和穩定性我們進行了三次重複（R2= 0.9977）。在NTC（無模板對照）孔中沒有觀察到陽性微滴。


當使用EvaGreen®方法進行數字PCR實驗時，需要注意，加入PCR mix的模板dsDNA濃度過高將導致較高的背景螢光。此外，EvaGreen®染料與dsDNA具有較高的親和力，但同時也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力，導致背景螢光的增加。 

根據您所需定量的DNA類型和數字PCR反應體系，需要預估實際的動態範圍。



圖2：EvaGreen®絕對定量散點圖


對未片段化的人類的基因組DNA進行倍比稀釋後，濃度範圍1000-0.2copies/μL，使用NaicaTM Crystal全自動微滴晶片數字PCR儀系統進行絕對定量，使用1.5XEvaGreen®，1XPerfeCTa @ UNG Tough mix，擴增片段大小為104bp的EGFR基因片段。

灰色點：陰性微滴，藍色點：陽性微滴。

RFU：相對螢光強度。


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