富含梭菌的微生物群促進腹瀉型腸易激症候群膽汁酸排洩

腹瀉症狀是大多數患者通過稀便（從可流動到水樣），儘管也存在異常頻繁的排便（每天2次排便）。腹瀉代表腸功能的改變，由於多種原因，腸道對水的淨吸收減少，導致糞便含水量高。腸易激症候群（irritable bowel syndrome，IBS）是一組持續或間歇發作，以腹痛、腹脹、排便習慣和（或）大便性狀改變為臨床表現，而缺乏胃腸道結構和生化異常的腸道功能紊亂性疾病。個體IBS患者中發現產生症狀的特定機制是困難的，因為缺乏具有足夠敏感性和特異性的測試來鑑定這些原因，並且證明鑑定該機制可以導致迅速而有效率的治療。

近日，一篇發表發表於《The Journal of Clinical Investigation》來自中國香港特區香港浸會大學中醫學院的研究成果：A Clostridia-rich microbiota enhances bile acid excretion in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome（富含梭菌的微生物群促進腹瀉型腸易激症候群膽汁酸排洩），其結果闡明了富含梭狀芽胞桿菌的微生物群可以通過靶向反饋調控糞便膽汁酸的合成來誘導糞便膽汁酸的過度排洩。研究結果還提示了一種新的治療策略，即以糞便膽汁酸轉化細菌為靶點治療腹瀉型腸易激症候群患者的膽汁酸腹瀉。研究人員認為，準確描述腸道微生物區系及其代謝物，結合腸道微生物區系的結構和功能特徵，將提高現有腸易激症候群基於症狀的治療的精確度。

摘要

糞便膽汁酸(BAs)過多被認為是腹瀉型腸易激症候群(IBS-D)的發病機制之一。然而，導致BA排洩過多的因素仍未完全研究。這篇研究證實了富含梭狀芽孢桿菌的微生物群導致IBS-D患者BA排洩過多。通過BA相關代謝分析和宏基因組學分析，發現24.5%的IBS-D患者存在總BAs排洩過多和糞便中BA轉化菌改變。通過一系列的動物和細胞實驗，闡明了富含梭狀芽胞桿菌的微生物群可以通過靶向反饋調控BA的合成來誘導BA的過度排洩。研究結果還提示了一種新的治療策略，即以BA轉化細菌為靶點治療IBS-D患者的BAD。

背景

以排便習慣不規則為特徵的腸易激症候群(IBS)影響著全球10%的人口，其中以腹瀉為主的IBS(IBS-D)在西方國家和亞洲的患病率較高。臨床研究表明，在IBS患者中，糞便總膽汁酸的增加與腹痛和結腸傳輸加速運動顯著相關。動物研究表明，BAs直接誘導結腸運動加速和內臟超敏反應。相反，使用隔離劑減少BA的分泌可以部分緩解IBS-D患者的症狀。這些觀察結果證明了BA在IBS發展過程中的重要性。然而，過量的BA分泌是如何產生的還不完全清楚。通常情況下，BA主要由限速酶膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)合成，然後與肝臟中的胺基酸結合。大部分結合的BA被釋放到腸道，從遠端迴腸被重新吸收，並通過門靜脈回流到肝臟，這一過程被稱為腸肝循環。少量逃過腸道吸收的BAs最終每日隨糞便排出，可通過肝新生合成補充。肝臟和迴腸中的BA合成速率受法尼醇X受體介導(FXR介導)反饋機制的可逆控制。腸道菌群在胃腸道中負責初級BAs向次級BAs的轉化，並與宿主相互作用以控制BA的合成。

實驗設計

1.受試者和樣本採集

290名符合羅馬IV診斷標準的IBS-D成人患者和91名健康受試者（HC）提供空腹血液和早晨第一次糞便。被要求在抽樣前至少一個月停止使用抗生素、益生菌、益生元和其他與腸道菌群相關的補充劑。人體樣本(血清和糞便)用乾冰運送到實驗室，並在-80°C冷凍。其中糞便總膽汁酸排洩量(≥為10.61molmol/g)的71名IBS-D患者歸為BA+IBS-D組，剩餘219名糞便膽汁酸排洩量正常(<10.61mol/g)的IBS-D患者歸為BA-IBS-D組。

2.糞便移植實驗

ABX由萬古黴素(50

mg/kg)、新黴素(100 mg/kg)、甲硝唑(100

mg/kg)、兩性黴素B(1 mg/kg)和氨苄西林(1

mg/mL)組成。成年雄性C57BL/6J小鼠在糞便移植前連續10天給予ABX，誘導為偽無菌小鼠模型（共71隻）。HC和IBS-D供體(n=11-12個/組)的糞便樣本分別製備為微生物菌群PBS懸液(50 mg/mL)。用2 0 0μL菌群懸浮液每日灌胃，連續5天。在基線(ABX幹預前)、FMT前(ABX幹預後)和FMT後收集糞便樣本，以監測細菌密度。最後，麻醉後收集盲腸內容物檢測BA轉化菌的豐度和活性。收集其他標本(肝臟、迴腸和迴腸內容物)以分析BAs和/或BA相關基因和蛋白。

3.菌群定植實驗

選用18隻成年雄性C57BL/6J小鼠(n=6隻/組)。通過16S核糖體序列分析，鑑定出一株典型的BA轉化梭菌(C.scindens；ATCC，35704)。該菌株用腦心浸液肉湯(BHI，BD Biosciences)在厭氧條件下培養。在確認其體外BA轉化活性後，每天給1組小鼠灌胃1×108cfu/mL的C.scindens菌PBS懸液，連續7天。另一組小鼠給予0.1

mg/mL的萬古黴素，並以PBS為對照。

4.

BA對小鼠的幹預實驗

40隻成年雄性C57BL/6J小鼠分為5組(n=8/組)。4個實驗組分別以50 mg/kg體重的TCA、TCDCA、TUDCA或它們的混合物(T-bas)灌胃8周。第5組為生理鹽水對照組。治療結束後，取肝、迴腸組織標本，用實時定量PCR方法分析FXR、FGF19、SHP和BA合成酶(CYP7A1、CYP8B1)基因。

5.肝細胞和腸上皮細胞製備

L-02（肝細胞系）和NCI-H716（上皮細胞系）分別用含10%Gibco胎牛血清的DMEM培養基和RPMI 1640培養基培養在塑料培養皿中。分別用萬古黴素(10μM~40 0μM)和C. scindens (活體和熱滅活)處理L-02細胞24h，檢測它們對肝臟CYP7A1表達的影響。根據BAS激活FXR的EC50值範圍，分別用50μ的M-TCA、TCDCA、TUDCA和T-bAS處理L-02和NCI-H716細胞24h，分析BA-牛磺酸偶聯物對FXR、FGF19、SHP、CYP7A1和CYP8B1表達的影響。分別用GUDCA、GCDCA、GCA、CA、UDCA和7-KDCA處理NCI-H716細胞24h，觀察其對腸上皮細胞FXR和FGF19表達的影響。

6.糞便宏基因組數據處理和統計學分析

去掉低質量的鹼基和人類基因組，剩下83.59%的高質量序列。微生物多樣性的測定和分類群的鑑定使用已發表的人類腸道微生物組基因目錄資料庫對比後分析。通過BLASTP對KEGG基因資料庫(V79)進行功能同源基因(KO)預測。根據各自基因的相對豐度計算了門、屬、種和KO的相對豐度。Shapiro-Wilk檢驗，判斷人類糞便總膽汁酸的分布。基於Prism 7的斯皮爾曼相關係數分析總糞便總膽汁酸與其他生化和細菌特徵的關係。Benjamin-Hochberg方法對微分類群和BA轉化基因組進行了分析。臨床定量特徵、代謝產物和基因的變異，在多組比較時採用非參數Kruskal-Wallis檢驗，兩組比較時採用Mann-Whitney檢驗。具有統計學意義的差異被定義為P<0.05

主要結果

1.

IBS-D患者膽汁酸合成增強，同時伴有過多的膽汁酸排洩和腹瀉症狀加重。腸道菌群衍生的膽汁酸的組成(如GUDCA、UDCA、7-KDCA等)發生了變化。BA+IBS-D患者血清和糞便中BA轉化菌群異常，提示腸內轉化膽汁酸菌群的異常可能是該病的病因之一。

A).正常對照組（HC）和IBS-D患者組的糞便總膽汁酸分布直方圖。IBS-D組和HC組的糞便總膽汁酸排洩量呈偏態分布(經Shapiro-Wilk檢驗，P<0.05)

B)C).分別為血清7-羥基-4-膽甾烯-3-酮（C4）和成纖維細胞生長因子19的濃度在各組間的分布。)。BA+IBS-D組的血清C4升高，FGF19降低。

D)E)F).通過排便頻率（D）、布裡斯託大便分類法（E）、IBS嚴重程度評分系統（F）評估BA+IBS-D組和BA-IBS-D組之間的腸道症狀嚴重程度。在BA+IBS-D組中，糞便總膽汁酸水平與血清C4水平和腹瀉症狀評分(Bristol大便規模和排便頻率)呈正相關，而與血清FGF19水平呈負相關。

G)H).糞便中佔優勢的膽汁酸成分的絕對含量。I).糞便中佔優勢的膽汁酸成分在各組間佔的比例。圖例中僅顯示了佔膽汁酸總數1%以上的成分，I這些組分在BA+IBS-D組中都有顯著增加。

顯著性標記：與HC組比較（*P < 0.05, ***P < 0.005）；與BA-IBS-D組比較（#P < 0.05, ##P < 0.01,

###P < 0.005）

2.在BA+IBS-D組中存在一個特定的富含梭菌的微生物群，具有不同的基因組，用於BA去結合、C7異構化和脫羥基。IBS-D隊列中富含梭狀芽孢桿菌的微生物群與膽汁酸合成和排洩的增加有關。

A).與HC和BA-IBS-D組相比，BA+IBS-D組的糞便微生物群落表現出更高的Bray-Curtis差異。在BA+IBS-D亞組中，腸道生態系統的不穩定性更大。

B).BA+IBS-D組 厚壁菌門與擬桿菌門的比值顯著升高。

C)D)E).分別為轉化膽汁酸的基因組和細菌的相對豐度。Alistipes和Bacteroides菌的相對豐度降低主要與cgh基因有關。編碼7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-hsdh)的hdhA基因豐度增加歸因於大腸桿菌、梭菌、布魯氏菌、瘤胃球菌和梭狀芽孢桿菌種類的增加。

F)G). IBS-D隊列中細菌豐度與生化指標之間的斯皮爾曼相關性。梭狀芽孢桿菌的屬和種分類的相對豐度與糞便總膽汁酸和血清C4濃度呈正相關，與血清FGF19水平呈負相關。

顯著性標記：與HC組比較（*P < 0.05, ***P < 0.005）；與BA-IBS-D組比較（#P < 0.05, ##P < 0.01）。斯皮爾曼相關係數的統計學意義定義為P<0.05

3.移植富含梭狀芽孢桿菌的微生物群可以誘導受體小鼠腹瀉樣表型，促進膽汁酸的合成和排洩，但這些作用可能不依賴於膽汁酸的迴腸吸收和肝反饋抑制。

A). ABX誘導偽無菌小鼠糞便微生物區系移植的實驗程序(n=6/組)。接受HC供體糞便微生物群的小鼠歸為ABX+HC組，接受BA+IBS-D和BA-IBS-D供體糞便微生物群處理的小鼠分別歸為ABX+BA+和ABX+BA-兩組

B). 小鼠的胃腸道轉運時間和糞便含水量。微生物移植一周後，BA+IBS-D微生物群受體小鼠的胃腸道轉運時間縮短，糞便含水量增加。這與供體的腹瀉症狀相似。

C). 基於qPCR分析，供體和受體小鼠糞便中膽汁酸相關細菌的相對水平。受體的膽汁酸轉化細菌的糞便特徵與BA+IBS-D供體相似，擬桿菌的豐度降低，而厚壁菌門、梭菌集群XIVa和梭狀芽胞桿菌的豐度升高。

D)E). 小鼠糞便總膽汁酸和血清C4水平。F). 小鼠肝臟中膽汁酸譜。BA+IBS-D微生物群受體小鼠的糞便總膽汁酸和血清C4增加，肝臟和迴腸腔中牛磺酸結合的BAs（T-βMCA、TCA、TCDCA和TUDCA）升高。

G). 膽汁酸合成調節因子在小鼠肝組織中的相關基因表達。在BA+IBS-D微生物群受體中，肝臟組織中Cyp7a1mRNA和Cyp8b1mRNA的基因表達增加，但Shp和迴腸組織中Fgf15的基因表達降低。

4.梭狀芽孢桿菌的定植對小鼠膽汁酸合成和排洩的調控作用。梭狀芽孢桿菌對膽汁酸排洩增加和腹瀉樣表型的影響參與了法尼醇X受體（FXR）介導的膽汁酸合成的反饋控制。

A).通過導入Clostridium Scindens菌株（C.s）或注射萬古黴素（0.1 mg/mL，VAN）來調控梭狀芽胞桿菌。對照（CTR）

B). 梭狀芽孢桿菌處理小鼠的胃腸道轉運時間和糞便含水量。與經賦形劑處理的小鼠（CTR）相比，梭狀芽胞桿菌的定植顯著降低了糞便稠度。萬古黴素的治療顯著降低了胃腸道轉運速度。

C). 基於qPCR分析，供體和受體小鼠糞便中膽汁酸相關細菌的相對水平。與CTR組相比，梭狀芽胞桿菌定植小鼠的盲腸中的Clostridium

Scindens菌豐度顯著增加，經萬古黴素處理的小鼠盲腸中梭狀芽孢桿菌的數量明顯減少。

D)E). 小鼠糞便總膽汁酸和血清C4水平。在梭狀芽胞桿菌定植小鼠中，糞便總膽汁酸和血清C4濃度顯著增加，但經萬古黴素處理的小鼠中，這些都降低了。

F). 小鼠肝臟中膽汁酸譜。牛磺酸結合的BAs（T-βMCA、TCA和TUDCA）在梭狀芽胞桿菌定植小鼠中的肝臟和迴腸腔中顯著增加，而萬古黴素處理的小鼠中則顯著降低。

G). 膽汁酸合成調節因子在受體小鼠肝組織中的相關基因表達。Cyp7a1mRNA在梭狀芽胞桿菌定植小鼠肝臟中表達升高，但在萬古黴素處理的小鼠中顯著降低。Fgf15mRNA在梭狀芽胞桿菌定植小鼠迴腸中表達降低。FGFR4和KLB在各組間的表達差異無統計學意義。

5.梭狀芽胞桿菌衍生的膽汁酸組分對腸道FXR負反饋信號的有抑制作用。富含梭狀芽孢桿菌的微生物群導致某些次級BA(例如UDCA、UDCA結合物和7-KDCA)比例較高，這些BAs可以減弱腸道FXR/FGF19信號，從而促進IBS-D患者肝臟合成和糞便排洩的增強。

A)B). 牛磺酸偶聯BAs幹預FXR基因及其靶基因在小鼠肝臟和迴腸的表達。TUDCA降低了小鼠迴腸中FXR基因的表達。TCDCA、TUDCA和T-BAs降低小鼠迴腸中Fgf15表達，升高肝臟中Cyp7a1表達。4種BA處理對肝臟FXR表達均無影響，但TUDCA可增加Shp在肝臟中的表達。

C). Western blot顯示FXR和FGF19在從小鼠富含梭狀芽孢桿菌的微生物群中衍生出的膽汁酸-牛磺酸偶聯物處理的腸細胞中的表達。T –BAs是TCA, TCDCA和TUDCA的組合。TUDCA和T-BAs都顯著降低了NCI-H716腸細胞中FGF19的表達，這與體內觀察結果相似。

D).FXR和FGF19基因在人體富含梭狀芽胞桿菌的腸上皮細胞中的表達。E). 在FXR激動劑CDCA和梭菌衍生物膽汁酸的聯合作用下腸上皮細胞FGF19基因表達的研究。CDCA和CA激活FXR並顯著上調FGF19的表達。其它BAs對FXR無影響，但能有效拮抗CDCA誘導的FXR激活。

結論

這項研究在BA+IBS-D患者中發現了一種富含梭菌的微生物群，其BA轉化活性不平衡。富含梭狀芽孢桿菌的腸道菌群失調與BA合成/排洩增加有很強的相關性。富含梭狀芽孢桿菌的糞便微生物群移植或梭狀芽孢桿菌的定植顯著促進了小鼠受體BA的合成和排洩。機制實驗表明，梭狀芽孢桿菌衍生的BAs可減弱腸道BA反饋抑制。研究人員認為，準確描述腸道微生物區系及其代謝物，結合腸道微生物區系的結構和功能特徵，將提高現有IBS基於症狀的治療的精確度。

本文轉載自谷禾健康