柱狀假絲酵母脂肪酶的研究進展及應用

柱狀假絲酵母(Candida cylindracea)又稱為褶假絲酵母(Candida rugosa)，是一種 半子囊無孢子、假絲狀、單細胞、非致病的酵母菌。該酵母通常被認為是對人類和其它生命形式都是安全的。在巧克力的生產過程中，皺褶假絲酵母起到了很大的作用。它能將種子內的這些糖轉化為乙醇，並分解果膠質。

一、定義

柱狀假絲酵母(C. cylindracea)，是一種半子囊不產孢子的假絲狀單細胞非致病酵母真菌。該酵母通常被認為是對人類和其它生命形式都是安全的。其所產的脂肪酶（C. rugosa lipase , CRL）廣泛應用於傳統與現代工業，如脂肪酸的生產、各種酯類的合成等，是當前世界上應用最廣泛的商品化脂肪酶之一。

另外，在巧克力的生產過程中，柱狀假絲酵母起到了很大的作用。可可樹的種子內含有大量的糖，非常適合柱狀假絲酵母的生長。它能將種子內的這些糖轉化為乙醇，並分解果膠質。如果沒有柱狀假絲酵母的參與，最終的產品是非常苦澀的。最終，柱狀假絲酵母會由於高濃度的醇而死亡，可可豆經過一些後續化處理如乾燥，包裝得到最終的產品。

二、柱狀假絲酵母脂肪酶

大多數微生物脂肪酶分子量在 30-40 kDa 之間，而 C. rugosa 脂肪酶（CRL）和Geotrichum candidum 脂肪酶（GCL）分子量較大，約 60 kDa。CRLs 和 GCLs 是一類與膽鹼酯酶（cholinesterase）結構類似的脂肪酶，都具有 α/β 水解酶的摺疊結構和Ser-His-Glu 三聯體催化中心。隨著脂肪酶的純化及 基因克隆與表達研究的深入，發現兩種屬脂肪酶均存在基因多態性現象，在 C. rugosa 中發現至少有 7 種脂肪酶同工酶，G. candidum 為 2 種，這些同工酶在一級結構和理化性質上都存在差異。工業上廣泛用作催化劑的 GCL 和 CRL 大多是混有幾種同工酶的粗酶。

三、柱狀假絲酵母脂肪酶研究進展

1990 年，有研究首次報導了 C. rugosa lip1 的突變體核酸序列，到目前為止，先後從 C. rugosa 克隆出 8 個脂肪酶基因，研究者通過 Southern 雜交從 C. rugosa 基因組文庫中分別得到 lip1~lip5 全長核酸序列，並預測 lip6 和 lip7 基因。其中 lip1、lip3、lip4 和 lip5 基因序列全長為 1650 bp，lip2 基因序列全長為 1647 bp。研究發現這些同工酶的基因均不含內含子，基因定位在 C. rugosa 的 I 號染色體上，成熟的脂肪酶包含 534 個胺基酸，分子量約為 60 kDa，等電點在 4.5~6.0 之間，具有不同的糖基化程度和底物特異性，但是基因的同源性高達 70%。隨後 Xu 等從 C.rugosa (ATCC14830) 菌株中克隆得到 lipJ08 基因，全長 1650 bp，編碼 549 個胺基酸，其中包含一個 15 個胺基酸殘基的信號肽，成熟的脂肪酶包含 534 個胺基酸，與該菌株同工酶的一級序列比對，同源性高達 89%。研究發現 C. rugosa 不遵循常用的密碼子系統，通常編碼亮氨酸的密碼子 CTG，在 C. rugosa 中編碼絲氨酸 (Ser) ，包括在 CRL各組分中的催化位點 Ser209 也是由 CTG 編碼。因此，C. rugosa 脂肪酶基因直接異源表達，得到的是無活性的蛋白。為解決這個問題，可以選擇密碼子使用模式相同的微生物作為宿主菌株或者將非常規密碼子 CTG 改為 TCT 再進行異源表達。Brocca等首次用全基因合成方法將密碼子 CTG 突變為 TCN，其中包括催化位點Ser209，合成了的 lip1 基因，並在 Saccharomyces cerevisiae 和 Pichia pastoris 中異源表達，都得到有活性的蛋白，且轉入 P. pastoris 的轉化子在 1-L 搖瓶中 pH 6.0 條件下，發酵 280 h 酶活達到 150 U/mL，且對 C8 和 C10 長度的脂類顯示較高的水解活力。

隨後 Tang 等採用重疊延伸 PCR 技術將 lip4 基因中 19 個編碼絲氨酸的密碼子 CTG 進行改造，分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進行表達。lip4 有唯一一個柱狀假絲酵母脂肪酶糖基化位點 Asn-351，在畢赤酵母中表達的重組酶經過糖基化後，熱穩定從 52 °C 升至 58 °C，但是催化性質與大腸桿菌中表達的產物沒有明顯差異。對兩種重組脂肪酶活性測定，發現對長鏈酯(C16 和 C18)有較高的酯活力，對不飽和的長鏈脂肪也有較高的活性。

2002 年，Lee 等克隆 C.rugosa 的脂肪酶 lip2 基因利用 Overlap extension PCR技術將該基因中的 17 個編碼絲氨酸的 CTG 密碼子突變為 TCT，在 P. pastorisSMD168H 成功表達。該酶最適 pH 為 7.0，在最適溫度為 30~50 °C，對 C12~C16 的對硝基苯酯有較高的水解活力，轉酯和醇酯化效果最佳的底物分別是丁酸和 C18。同時，對三丁酸甘油脂和十二酸膽固醇酯活性最高。Ferrer 等將 lip2 用 AOX 作為啟動子在畢赤酵母中異源表達，重組酶 LIP2 的表達量比原始 C.rugosa 菌株發酵 LIP2產量提高了 10 倍。

2005 年，Chang 等人應用 RT-PCR 技術從 C.rugosa(X64703)菌株基因組中克隆 lip1 基因，利用 Overlap extension PCR 技術將該基因的成熟肽 19 個編碼絲氨酸的CTG 密碼子突變為 TCT，以 P. pastoris KM71 作為宿主菌株，表達產物經純化後，以三丁酸甘油酯為底物，酶活力為 253.3 U/mL。

2006 年，Chang 等將 lip3 中 18 個編碼絲氨酸的 CTG 密碼子用重疊延伸 PCR技術定點突變為 TCT；同時將 5』端 339 個鹼基進行密碼子優化，改造後的兩段基因在畢赤酵母中表達出有活性的蛋白，密碼子優化後表達的重組酶活力比未優化的提高 1.44 倍。重組脂肪酶的最適溫度範圍為 20~50 °C，最適 pH 4.0~6.0，對 C8~C12的 pNP 酯有較高的水解活力。

2011 年，Lee 等將 lip5 基因的 16 個編碼絲氨酸的 CTG 密碼子定點突變，在畢赤酵母中表達。重組 LIP5 在最適反應溫度為 50 °C，最適 pH 為 8.0。研究底物特異性發現，重組酶對短鏈 pNP 酯(C4)、丁醯輔酶 A (C4)有較高的水解活性， LIP5與 LIP4 和 LIP2 都對短鏈底物有較好的水解作用。

四、柱狀假絲酵母脂肪酶應用

柱狀假絲酵母脂肪酶可以催化水解、醇解、轉酯和酯化等多種反應，根據該酶的不同特性應用於工業的不同領域。CRLs 對甘油三酯中的 Sn-2 和 Sn-1/3 位酯鍵的識別和水解具有不同選擇特異性且對底物的立體對映結構 1 位和 3 位酯鍵的表現出較高的識別特異性和對映選擇性，因此，常用於製備對映體有機化合物，藥物手性拆分，外消旋醇和酯的動力學拆分和催化合成大量藥品，例如催化合成有光學活性的非甾醇類抗炎藥(苯酮苯丙酸、萘普生、布洛芬)，生物鹼類的光學異構體合成、抗生素、二級醇、生化抑制劑和前藥等。Chen 等固定化 C. rugosa 脂肪酶後在環己烷中合成了(S)－布洛芬酯。利用 C. rugosa 脂肪酶對長鏈不飽和脂肪酸催化活性低這一特性，可以從魚油中生產 EPA 和 DHA。除此以外，柱狀假絲酵母脂肪酶還被廣泛應用於生物傳感器、生物材料、生物降解和生物識別等領域中。

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