白假絲酵母（Candida albicans）屬於食源性致病酵母菌，近年來在國內外食品中常檢出C. albicans，其中乳製品是易被其汙染的第一大類產品。C. albicans作為食品中的條件致病菌，其致死率可達40%，所以對其毒性和菌絲生長的研究極為重要。
環磷酸腺苷（cAMP）和環磷酸鳥苷（cGMP）作為生物體內第二信使調控著重要的生理代謝反應，而磷酸二酯酶（PDE）是降解環核苷酸的一類酶。在哺乳動物細胞中存在約30 種PDE，但是在真菌生物中，目前僅有兩類PDE被發現，其中PDE1屬於II類PDE超家族成員，而PDE2屬於I類PDE超家族成員，其對cAMP具有較高的親和力，且PDE2與人類PDEs蛋白具有相似的摺疊結構。目前對C. albicans PDE2蛋白的研究已成為其假菌絲生長和毒性調控的重要研究方向。
北京食品營養與人類健康高精尖創新中心、北京工商大學輕工科學技術學院的李赤霞、陳瀅和王友升*等人將大腸桿菌作為表達載體，通過異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導目的蛋白異源表達，利用3 種層析方法進行純化，獲得高純度C. albicans PDE2蛋白，並通過高效液相色譜（HPLC）分析PDE2蛋白酶的特性。旨在為該蛋白的晶體學分析及C. albicans的生理病理機制研究提供前期基礎。
運用酚-氯仿法提取C. albicans基因組DNA，結果見圖1a，在10 000 bp以上有明顯條帶，證明成功獲得了C. albicans基因組DNA。利用C. albicans pde2基因引物，通過PCR擴增目的基因片段，DNA凝膠電泳如圖1b所示，在1 500～2 000 bp之間有明顯的條帶，大小與C. albicans pde2基因的大小（1 716 bp）一致，證明目的基因片段可以被正確擴增。
將擴增所得C. albicans pde2目的片段與pGM-T載體相連，雙酶切驗證電泳結果見圖2a，3 000 bp處條帶為載體pGM-T條帶，1 700 bp處條帶為目的基因條帶，證明成功獲得pGM-T-C. albicans pde2質粒。將酶切後膠回收產物與pET28a載體酶切產物連接，獲得重組pET28a-C. albicans pde2質粒。對所構建的重組質粒進行雙酶切驗證，由圖2b可知，酶切後在6 000 bp和1 700 bp左右有明顯條帶，其中6 000 bp處為pET28a質粒載體條帶，1 700 bp左右的條帶為目的基因條帶，證明重組pET28a-C. albicans pde2質粒構建成功。
3 pET28a-C. albicans pde2重組質粒誘導表達
IPTG低溫誘導48 h後收集菌體5 g/L，分別取樣誘導24 h和48 h的菌體，SDS-PAGE見圖3。誘導24 h，蛋白表達量較少，幾乎沒有目的蛋白條帶。誘導48 h後，60 kDa處蛋白含量顯著增加，該條帶與預期目的蛋白（約62 kDa）條帶一致，表明該誘導條件能夠在IPTG誘導48 h後獲得大量的目的蛋白，最終獲得菌體4.5 g/L。
4 C. albicans PDE2蛋白的分離純化
重組質粒誘導將C. albicans PDE2表達菌體超聲破碎後取樣進行SDS-PAGE，結果如圖4a所示，離心上清液中目的蛋白含量極高，證明該誘導條件下目的蛋白水溶性較強，形成極少量的包涵體。將離心上清液蛋白加入Ni-NAT親和層析柱中進行分離純化，最終獲得70 U蛋白。對蛋白含量大於1 U收集管取樣進行SDS-PAGE，結果見圖4b，目的蛋白條帶佔比高，說明重組目的蛋白與Ni-NAT柱親和能力強，且經過蛋白純度明顯升高。證明Ni-NAT柱能夠對目的重組蛋白進行有效的分離純化。
Ni-NAT柱分離純化後的蛋白，進行24 h的透析置換。牛凝血酶切除目的蛋白的His-tag標籤，使目的蛋白更好地與Q-Sepharose柱結合，結果見圖5a，經過3 h的室溫酶切，蛋白分子質量有明顯降低，證明該酶切條件適合重組目的蛋白。酶切後的蛋白質經過Q-Sepharose柱分離純化，共收集目的蛋白55 U，結果如圖5b所示，電泳結果幾乎沒有雜蛋白條帶，說明雜蛋白的含量明顯降低，因此證明Q-Sepharose柱可以使目標蛋白得到進一步分離純化。
將Q-Sepharose柱純化的蛋白濃縮並加入Sephacryl S200柱，通過分子篩分離純化，SDS-PAGE檢測結果如圖6a所示，Sephacryl S200柱純化後，目的蛋白純度得到進一步提高。利用非變性凝膠電泳檢測濃縮後純化蛋白的活性，如圖6b所示，結果表明經過多步純化後，目的蛋白條帶清晰可見且沒有雜蛋白條帶，說明Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分離純化過程中C. albicans PDE2蛋白沒有發生凝聚，能夠維持其生理結構和生物學活性，且蛋白純度得到極大提高。以Ni-NTA柱純化得到的蛋白含量為100%，計算Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱純化過程中蛋白的回收率。結果顯示，C. albicans PDE2蛋白在每步純化過程中，損耗約30%蛋白，這可能是由於蛋白純度的增高導致，同時在經歷柱層析時，目的蛋白也存在著一定量的流失。最終平均每克表達菌體可獲得2.8 U目的蛋白。5 C. albicans PDE2蛋白酶活性分析
應用HPLC法測定所獲得的目的蛋白酶活力，測定不同濃度蛋白對cAMP和cGMP的水解率，且將底物設置為0.4 mmol/L的單底物與雙底物兩種體系，通過其對兩種體系的水解情況，確定其對於cAMP和cGMP的親和作用，在單底物的情況下，相同質量濃度的C. albicans PDE2對cGMP的水解能力略低於cAMP，說明C. albicans PDE2對cAMP具有更高的親和力。在雙底物的體系中，0.385 mg/mL質量濃度下，0.05 mmol/L和0.1 mmol/L濃度的cAMP能夠被完全水解，但0.05 mmol/L濃度的cGMP水解率僅達到了53.53%，說明雙底物體系中C. albicans PDE2優先水解cAMP。因此，兩種體系均證明了C. albicans PDE2對cAMP具有更高的親和力。
目前，廣大研究學者對真菌的調控進行了廣泛研究，其中環核苷酸磷酸酶PDE能夠對真菌起到重要的調控作用。本研究通過IPTG誘導大量表達蛋白菌體，通過多種柱層析手段對目的蛋白進行分離純化，最終得到高純度的C. albicans PDE2蛋白，平均每克表達菌體可獲得2.8 U蛋白。通過HPLC檢測底物減少量或產物生成量分析蛋白酶的水解能力，從而確定所獲得的酶活力。結果表明所純化的蛋白具有較高的水解cAMP和cGMP的能力，其在0.385 mg/mL質量濃度下，對0.4 mmol/L的cAMP和cGMP的水解率達到60%～70%，這與前期報導釀酒酵母PDE1作用方式一致。但是該酶對cAMP的親和力高於cGMP。本研究得到高純度、高活性的C. albicans PDE2，為蛋白的晶體學解析提供前期基礎，以期進一步篩選以該酶為靶點的天然活性物質，以及解析食品中C. albicans的生長和致病性調控機制。
本文《白假絲酵母環核苷酸磷酸二酯酶2的異源表達、純化與酶學特性分析》來源於《食品科學》2020年41卷22期82-87頁，作者：李赤霞，陳瀅，張萌，陳玉娟，田元元，王友升。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191012-092。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。