細菌cGAS/DncV樣核苷酸轉移酶下遊效應蛋白——Cap4

撰文 | 敏君

責編 | 兮

cGAS/DncV樣核苷酸轉移酶（cGAS/DncV-like nucleotidyltransferases，CD-NTases）是一類合成核酸第二信使的免疫感知酶類，能夠激活級聯繫統並調控下遊反應，以啟動細菌以及動物細胞中的初始抗病毒反應。CD-NTase在動物和細菌信號傳導系統中均相當保守，在先天免疫和噬菌體防禦過程中發揮了至關重要的作用【1】（詳見：Nature深度|細菌中也有cGAS？哈佛科學家發現發現一大類cGAS/DncV樣核苷酸轉移酶）。人類CD-NTases環鳥苷酸（GMP）-AMP合成酶（cGAS）在病原體複製和癌症發生過程中能夠感知細胞內異常定位的雙鏈DNA，產生核苷酸第二信使2』-5』,3』-5』 cyclic GMP-AMP (2』3』-cGAMP)，誘導抗病毒免疫和幹擾素信號發生【2】。

細菌中含有5600多個特異性CD-NTases酶，它們可以控制多種統稱為CBASS（cyclic oligonucleotide-based antiphage signaling system)的抗病毒免疫系統【3】。細菌CD-NTases通過合成環二核苷酸和環三核苷酸產物，利用所有四種核糖核苷酸構成其信號的特異性，並增加CBASS抗病毒免疫反應的多樣性【4】。在人類細胞中，cGAS產物2』3』-cGAMP中的非典型2』-5』連接鍵對於免疫特異性和下遊受體STING（stimulator of interferon genes）的激活至關重要【5】。然而，在細菌CBASS抗病毒免疫中，受體的激活是否依賴於磷酸二酯鍵特異性仍然未知。

至今為止，研究較為透徹的細菌CD-NTases核苷酸第二信使受體為patatin樣磷脂酶，在核苷酸信號結合時被激活從而降解膜磷脂。如霍亂弧菌Vibrio cholerae中CapV（cGAMP-activated phospholipase in Vibrio）能夠響應3』3』-cGAMP並引起細胞膜破裂和細菌細胞死亡【6】。CBASS操縱子對單核苷酸第二信使具有較高特異性，然而迄今在CBASS操縱子編碼的細菌CD-NTase酶中尚未發現CapV樣受體，表明下遊效應蛋白仍有待發掘。

近日，來自哈佛醫學院的Philip J. Kranzusch團隊在Cell雜誌上發表了題為CBASS Immunity Uses CARF-Related Effectors to Sense 3』–5』- and 2』–5』-Linked Cyclic Oligonucleotide Signals and Protect Bacteria from Phage Infection的研究論文。該研究主要以陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae, E. cloacae）為研究對象，從一個含有2000多個成員的能夠響應CD-NTases的細菌受體家族中，發現了一個重要的核苷酸第二信使受體家族蛋白，即CD-NTase相關蛋白4（CD-NTase-associated protein 4，Cap4）。研究證明Cap4能夠通過SAVED結構域敏銳地辨別細菌中的2』-5』和3』-5』環寡核苷酸信號，進而識別核苷酸第二信使簇，在細菌抵禦噬菌體感染過程中發揮了重要作用。

E. cloacae CD-NTase CdnD (CD-NTase in clade D，EcCdnD)在體外具有組成型活性，可以合成環三核苷酸第二信使3』3』3』 cyclic AMP-AMP-GMP（3』3』3』-cAAG）【1】。EcCdnD操縱子包括三個未知功能的基因，編碼了CD-NTase相關蛋白2、3和4（CD-NTase-associated protein，Cap2、Cap 3和Cap 4）。首先，作者通過凝膠遷移實驗（EMSA）發現EcCap4是特異性識別EcCdnD核苷酸第二信使的下遊受體，且Cap4蛋白能夠利用類II型限制酶反應來降解DNA，是依賴於核苷酸第二信使門控酶激活調控的dsDNA內切酶。而後，作者進一步研究了CD-NTase-Cap4信號的特異性，發現CD-NTase合成的非典型2』-5』磷酸二酯鍵RNAs也參與了細菌的抗病毒信號傳導，而Cap4核酸酶作為選擇性傳感器，可以利用連接鍵的特異性來適應不同的CD-NTase核苷酸第二信使信號。

進一步對CD-NTase-Cap4複合體的結構進行探究，作者發現SAVED結構域是參與III型CRISPR免疫的兩個CARF（CRISPR-associated Rossman fold）結構域的融合形式，並且Cap4中SAVED結構域的單鏈結構能夠辨別不同的非對稱性核苷酸識別信號。隨後，作者研究了Cap4依賴配體激活的機制，發現Cap4的激活遵循了一個「兩步模型」，即SAVED結構域識別核苷酸第二信使後Cap4發生寡聚化，而後Cap4與底物DNA結合併使DNA靶向降解。Cap4調控模型中，配體誘導的寡聚化激活了Cap4的內切酶結構域，並致使基因組或質粒DNA被隨機切割成僅6 bp左右的小片段。

從已知序列的CD-NTase操縱子中，作者發現有29.8%的蛋白含有SAVED結構域，其中就包括CBASS抗噬菌體免疫的效應分子。因此，核苷酸第二信使誘導的SAVED寡聚化是激活不同效應分子功能的普遍策略，用以限制噬菌體複製從而保護細菌抵抗噬菌體感染。最後，作者檢測了CD-NTase信號通路的特異性，發現含有SAVED結構域的蛋白能夠專一地識別特定的核苷酸第二信使，這種核苷酸配體的特異性使得CBASS免疫具有獨立於其他宿主信號的特性。

總之，本文發現Cap4是細菌響應CD-NTase信號的關鍵成員，Cap4中 DNA內切酶/ DUF4297結構域的激活是通過配體介導的寡聚化進行的，而寡聚核苷酸識別則發生於由兩個CARF亞基融合形成的SAVED結構域。SAVED效應物能夠精確地辨別3』-5』和2』-5』環寡核苷酸信號，並能特異性識別至少180種潛在的核苷酸第二信使簇，表明SAVED/CARF家族蛋白是CBASS和CRISPR免疫抵抗中的重要核苷酸第二信使受體。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.019

製版人：老翅膀

參考文獻

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