「技術知識」原代細胞培養

2020-12-06 豐暉生物

什麼是原代細胞培養?

顧名思義，從體內分離出來的組織或細胞的第一次培養稱為原代培養。更成熟的概念是，凡是來源於胚胎、組織器官及外周血，經特殊分離方法製備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術是細胞培養工作的基礎。

原代細胞培養的步驟：取材→分離→培養和維持

1、取材

人和動物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。

(1) 取材的基本要求

① 取材要注意新鮮和保鮮

② 應嚴格無菌

③ 防止機械損傷

④ 去除無用組織和避免乾燥

⑤ 應注意組織類型、分化程度、年齡等

⑥ 作好記錄

2、分離

人或動物體內(或胚胎組織)由於多種細胞結合緊密，不利於各個細胞在體外培養中生長繁殖，必須將現有的組織塊充分散開，使細胞解離出來。

(1)懸浮細胞的分離方法

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是採用1000r/min的低速離心10分鐘。經離心後由於各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收穫目的細胞。

(2)實體組織材料的分離方法

對於實體組織材料，由於細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可採用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。

① 機械分散法

特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用於處理纖維成分少的軟組織。

② 消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構鬆動，使團塊膨鬆，由塊狀變成絮狀，此時再採用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，製成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養後，細胞容易貼壁生長。

胰酶消化法-實驗步驟

一、實驗材料準備

1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。

Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。二、具體操作

1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超淨臺內（或將新生小鼠在超淨臺內）解剖取肝臟，置平皿中。

2. 用Hank's液洗滌三次，並剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。

3. 用手術剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉移至小青黴素瓶中。

4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。

5. 加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。

6. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。

7. 1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。

8. 加入Hank's液5 ml，衝散細胞，再離心一次，棄上清液。

9. 加入培養液1-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。

10. 將細胞調整到5x105/ml左右，轉移至25 ml細胞培養瓶中，37℃下培養。

注意事項

1. 自取材開始，保持所有組織細胞處於無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

2. 在超淨臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。

3. 凡在超淨臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。

4. 操作前要洗手，進入超淨臺後手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。

5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，並冷卻後才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加汙染機會。

7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作檯面上用品要布局合理。

8. 瓶子開口後要儘量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

3、原代細胞的培養和維持

(1)原代細胞的培養方法

① 組織塊培養法

組織塊培養是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種於培養瓶(或皿)中，瓶壁可預先塗以膠原薄層，以利於組織塊粘著於瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。

② 消化培養法

③ 懸浮細胞培養法

對於懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可採用低速離心分離，直接培養，或經淋巴細胞分層液分離後接種培養。

④器官培養

器官培養是指從供體取得器官或組織塊後，不進行組織分離而直接在體外的特定環境條件下培養，器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用於重點觀察細胞間的聯繫、排列情況和相互影響，以及局部環境的生物調節作用。

其他注意事項：

（1）原代培養材料的選擇，儘量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

（2）要注意無菌操作。

（3）整個取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右，不能過長，以確保胚胎細胞活性。

（4）運用消化法時胰酶溫度應低於37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此胰酶消化液中繼續消化了10min以上。所以胰酶不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。

（5）如使用組織塊法，則應待組織塊略乾燥，能黏附於瓶壁時再使之與培養液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。

（6）原代培養操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

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