拒絕假陰性,數字PCR技術更準確檢測新冠病毒

2021-01-10 騰訊網

對於新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的檢測，實時定量PCR一直是金標準。不過對於某些患者，qPCR的結果似乎每天都在變化，而且有不少假陰性。近期的研究表明，ddPCR檢測能夠減少假陰性結果，而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式數字PCR系統開發出新型冠狀病毒的檢測產品。

對於新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的檢測，實時定量PCR（qPCR）一直是金標準。不過對於某些患者，qPCR的結果似乎每天都在變化，而且有不少假陰性。近期的研究表明，ddPCR檢測能夠減少假陰性結果，而Bio-Rad Laboratories公司也利用其微滴式數字PCR系統開發出新型冠狀病毒的檢測產品。

數字PCR（ddPCR）不像傳統的RT-qPCR那樣需要根據標準品進行校準。而且，PCR反應被分割成數萬個小液滴，在這種情況下，PCR抑制劑對樣品的影響較小，檢測靈敏度提高。在病毒載量低的情況下，例如SARS-CoV-2病毒感染的早期或無症狀感染，這種檢測尤為重要。

Bio-Rad數字生物學中心的生命科學營銷主管Carolyn Reifsnyder表示，ddPCR對包含抑制劑的複雜樣品具有特殊優勢。「我們的檢測是終點PCR，因此不存在qPCR所具有的抑制問題，」她解釋說。「數字PCR讓您更有信心，不會出現假陰性。」

我國的研究人員本月在medRxiv上發表了兩項小型研究，表明數字PCR具有更高的靈敏度，並且能夠檢測出金標準RT-qPCR所錯過的感染。

第一項研究是在武漢疫情暴發期間對ddPCR檢測的評估。這項研究是由中國計量科學院、武漢和北京的疾控中心以及重慶大學聯合開展的。研究人員利用Bio-Rad的QX200系統，對103名疑似患者、75名密切接觸者和16名康復期患者進行檢測，並將結果與三種不同的RT-qPCR試劑盒進行比較。他們發現ddPCR的檢測限是兩個拷貝，總體準確度約為96%。

對於疑似感染SARS-CoV-2的發燒患者，使用ddPCR的檢測率從28%提高到87%。對於密切接觸者，陽性率從21%降低至1%。研究人員還發現，年長的康復期患者在較長時間內具有較高的病毒載量。他們認為，ddPCR的靈敏度提高，特別適合判斷這些患者是否應解除隔離。

第二項研究是由武漢大學的研究人員開展的。他們採集了57名患者的咽拭子，並比較了ddPCR和RT-qPCR的結果。研究人員在兩種檢測方案中使用了相同的引物和探針，發現ddPCR的檢測限比RT-qPCR低500倍以上，總體準確度大約為94%。而且，在14名康復期患者中，9名患者的RT-qPCR檢測結果為陰性，但實際上通過ddPCR可以檢測到病毒。

文章的資深作者、武漢大學病毒學國家重點實驗室的陳宇教授指出，咽拭子的病毒載量較低，而且由於大量的假陰性報告不可避免，導致未能及時診斷，儘早治療或中斷傳播鏈。

他指出，儘管小規模使用時ddPCR的成本略高於RT-PCR，但如果大規模使用，則成本幾乎相同。此外，考慮到ddPCR檢測的準確性更高，因此可能不需要像RT-PCR那樣對患者進行重複檢測，在這種情況下，ddPCR實際上比RT-PCR更便宜。

「我們建議將ddPCR作為標準RT-PCR的補充。RT-PCR陰性的結果可利用ddPCR再次檢測，因為RT-PCR的陽性結果是可靠的，」陳宇指出。他認為，目前應對COVID-19危機時，所有診斷SARS-CoV-2的方法（包括RT-PCR、ddPCR、IgM/IgG抗體檢測和CT掃描）都有所幫助，應根據實際情況選擇使用。

Bio-Rad的檢測策略

根據Reifsnyder的說法，Bio-Rad一直在開發基於探針的三重檢測，也就是檢測SARS-CoV-2 N基因上的兩個靶點，以及Rpp30基因，後者是人RNase P基因的標誌物，可作為陽性對照。該檢測使用鼻咽拭子和多孔板，因此可以同時運行96名患者的樣品。「不需要qPCR那樣的標準曲線，因此您不會浪費任何孔，」她說。檢測時間大約為五個半小時。

Bio-Rad與Biodesix合作開發了ddPCR檢測，並申請美國FDA的緊急使用授權，以便用於CLIA實驗室的檢測服務。此外，他們自己也在開展研究，爭取成為EUA的檢測製造商。同時，Bio-Rad還在與全球其他監管機構積極展開對話。

這款ddPCR檢測可在QX200系統以及QXDx系統上運行，QXDx系統在去年2月獲得了美國FDA的許可。Reifsnyder解釋說：「QX200和QXDx基本上是同一臺儀器。QXDx根據美國的臨床應用進行了調整，而QX200通過了CE-IVD認證。不過，隨著全球監管要求的放鬆，在疫情期間許多實驗室也能夠在RUO儀器上檢測SARS-CoV-2。」

除了臨床檢測，Bio-Rad還提供了多個產品來支持COVID-19的研究和診斷開發。例如，他們提供了一步法RT-qPCR預混液，該預混液經過優化，可直接從RNA中擴增靶點，此外還有SARS-CoV-2標準品以及陰性標準品。這些材料是由去年被Bio-Rad收購的Exact Diagnostics公司開發的。當然，還有CFX實時定量PCR檢測系統，包括CFX96 Dx、CFX96 Touch和CFX384 Touch。

Reifsnyder表示：「如今，我們正在全天候工作，向包括公司和政府實驗室在內的世界各地的實驗室提供qPCR產品。」 Bio-Rad並沒有透露具體的儀器安裝數量，但表示到目前為止已經放置了數千臺QX200儀器，而且QXDx的數量也在激增。「我們的製造工廠仍在運轉中……我們的QX200和CFX生產線仍在滿負荷運轉，全天候生產儘可能多的儀器。」

參考文獻

Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR

ddPCR: a more sensitive and accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens

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