醫學院布萊恩·科比爾卡研究組揭示G蛋白偶聯受體-G蛋白複合物形成...

醫學院布萊恩·科比爾卡研究組揭示G蛋白偶聯受體-G蛋白複合物形成過程

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清華新聞網5月15日電 5月9日，清華大學醫學院、結構生物學高精尖創新中心布萊恩·科比爾卡（Brian K. Kobilka）教授研究組於《細胞》 （Cell） 雜誌在線發表了題為《G蛋白偶聯受體- G蛋白複合物形成過程的結構機理》（Structural Insights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation）的研究論文。論文報導了 beta2 腎上腺素受體（β2AR）融合Gs蛋白羧基端肽段（GsCT）的晶體結構以及GDP結合狀態下Gs蛋白（Gs^GDP）的晶體結構，並基於結構首次提出了beta2 腎上腺素受體-Gs蛋白複合物在形成過程的初始階段可能的分子模型。《細胞》期刊同期還以背靠背的方式發表了布萊恩·科比爾卡教授在史丹福大學研究組的題為《G蛋白偶聯受體-G蛋白複合物的組裝》(Assembly of a GPCR-G protein Complex)的研究論文，報導了利用氫氘交換質譜分析和X射線輻射裂解蛋白印記質譜分析研究 beta2 腎上腺素受體與Gs蛋白複合物形成的動態過程的工作。兩篇論文相互印證，共同揭示了G蛋白偶聯受體與 G蛋白複合物形成的分子機理。

G蛋白偶聯受體（GPCR）家族在人體中有800多個成員，在視覺，嗅覺，味覺，以及激素和神經遞質的信號轉導中發揮著重要的生理功能，同時也是關鍵的藥物研發靶點。GPCR作為膜受體蛋白，對外感知胞外的配體信號，對內結合G蛋白或者Arrestin，將信號向下遊傳遞，調節細胞功能。在激動劑的作用下，GPCR會與二磷酸鳥苷（GDP）結合狀態的G蛋白，形成短暫的複合物（GPCR-G^GDP），誘發GDP的釋放，得到無核酸結合的GPCR-G蛋白複合物（GPCR-G^empty）。三磷酸鳥苷（GTP）隨後與GPCR-G^empty狀態下的G蛋白結合，引起 G蛋白解離成Gα 與 Gβγ亞基，進而激活下遊的靶蛋白，傳遞細胞信號（圖1）。 

圖1 GPCR與G蛋白複合物形成過程示意圖

布萊恩·科比爾卡教授在史丹福大學的課題組在GPCR結構生物學領域做出了開創性的工作。其於2007年首次獲得了beta2腎上腺素受體的非激活態高解析度結構，並於2011年利用模擬G蛋白的納米抗體穩定beta2腎上腺素受體的激活態構象，獲得了其激活態結構。更於2011年發表了beta2腎上腺素受體與Gs蛋白在無核酸狀態下（β2AR-Gs^empty）的複合物的晶體結構，首次在原子水平觀測到信號從配體傳遞到受體再到G蛋白，該研究是GPCR領域裡程碑式的成果。值得注意的是，在獲得β2AR-Gs^empty結構的研究中，研究者們使用核苷酸酶Apyrase水解去除複合物中的GDP，從而獲得更加穩定的無核苷酸結合的GPCR-G蛋白複合物（GPCR-G^empty） 。使用Apyrase水解GDP以獲得穩定GPCR-G蛋白複合物的方法，也成為了獲得GPCR-G蛋白複合物的通用方法。隨著冷凍電鏡技術的發展，目前在PDB資料庫裡面有超過10個不同GPCR-G蛋白複合物的結構，所有的複合物都被穩定在沒有核苷酸結合的GPCR-G^empty狀態。然而這些複合物結構並沒有很好的解釋 GPCR與G蛋白結合的特異性。多項研究表明，GPCR與GDP結合的G蛋白之間存在一個中間狀態的複合物。這個中間態的複合物可能代表了GPCR與G蛋白特異性識別的初始狀態。但由於該複合物是一個不穩定的中間態，其結構信息很難獲得。

相比於非激活態的GPCR，激活態的GPCR結構上最顯著的特點在於第六個跨膜螺旋的外移（ 10埃甚至更遠的距離）。布萊恩·科比爾卡教授研究組利用多種技術證明：在只有激動劑結合的情況下，beta2 腎上腺素受體無法穩定在激活構象，需要同時在胞內區域有其他蛋白（納米抗體或者G蛋白）穩定其激活態結構。布萊恩·科比爾卡教授多年以前啟動一個課題，試圖將Gs蛋白羧基端的肽段融合在beta2 腎上腺素受體的羧基端，以獲得其穩定在激活態的結構，但是該課題沒有成功。其在清華大學的研究組改進了蛋白編輯策略，將Gs蛋白羧基端的14個胺基酸（GsCT）融合在beta2 腎上腺素受體的胞內第三個環狀區域，並引入二硫鍵將GsCT穩定在其結合位置，最終獲得了3.7埃的 beta2 腎上腺素受體激活態下的晶體結構。在該結構中觀察到的 Gs蛋白羧基端與受體相互作用的方式不同於2011年解析的β2AR-Gs^empty複合物（PDB：3SN6）。Gs蛋白羧基端的兩個帶電的胺基酸E392^Gs和R389^Gs與受體相互作用，而在之前的β2AR-Gs^empty複合物中與受體結合的兩個胺基酸Y391^Gs和H387^Gs卻指向了相反的方向（圖2）。分子動力學模擬表明這種結合方式幾乎與β2AR-Gs^empty 的複合物中觀察到的結合方式一樣穩定。

圖2 beta2 腎上腺素受體與Gs蛋白C末端的14個胺基酸（GsCT）融合蛋白的晶體結構（A），在該結構中，帶電荷的胺基酸E392^Gs和R389^Gs與β2AR相互作用，而Y391^Gs和H387^Gs不參與β2AR的相互作用（B）。這一相互作用模式與β2AR-Gs^empty（PDB： 3SN6）結構裡觀察到的方式相反（C）

同時，研究組獲得了2.8埃的GDP結合狀態下Gs蛋白（Gs^GDP）的晶體結構，在該結構中，Gs蛋白羧基端的Y391^Gs和H387^Gs與Gs蛋白內部其它胺基酸形成了相互作用，而E392^Gs和R389^Gs則暴露在Gs蛋白的表面。因此推測E392^Gs和R389^Gs 更有可能參與GPCR受體與G蛋白之間的初始相互作用。隨後研究組通過多種生物化學手段和分子動力學模擬驗證了E392^Gs和R389^Gs 在受體與G蛋白形成複合物過程中的重要作用。最後研究組搭建了beta2 腎上腺素受體與GDP結合狀態下Gs蛋白的複合物（β2AR-Gs^GDP）的模型，並提出了從 Gs^GDP，到β2AR-Gs^GDP，最後到β2AR-Gs^empty的複合物形成的動態模型（圖3）。 

圖3 β2AR與Gs蛋白形成複合物的動態模型。在Gs^GDP狀態E392Gs和R389^Gs暴露在Gs蛋白表面（A）。Gs蛋白羧基端肽段經過小的構象變化（B）可以與β2AR形成中間態複合物β2AR-Gs^GDP（C），在該複合物狀態下，Gs蛋白利用帶電胺基酸E392^Gs和R389^Gs與β2AR相互作用。隨著GDP的釋放， β2AR-Gs^GDP 複合物經過構象變化，成為無核酸結合的β2AR-Gs^empty複合物（D），在β2AR-Gs^empty複合物中，Gs利用Y391^Gs和H387^Gs和β2AR相互作用

清華大學醫學院布萊恩·科比爾卡教授與劉翔宇博士為本文的共同通訊作者。清華大學劉翔宇博士， 博士生許心宇，以及史丹福大學Daniel Hilger博士為本文共同第一作者。清華大學醫學院劉洪濤博士、孫曉鷗博士、史丹福大學杜洋博士（即將成為香港中文大學（深圳）科比爾卡新藥研究院Tenure-track助理教授）參與了本項研究。本課題得到清華-北大生命科學聯合中心，北京市高精尖結構生物學中心的資助。

原文連結：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30440-4

供稿：醫學院

編輯：李華山

審核：周襄楠