作者：中國科學院大學華大教育中心 小七仔
AV8D,大噶猴呀
泥萌的小七仔首次上線營業啦！
細細數來，我也算是細胞培養的老手了，培養過不同類型的細胞，也遇到過各式各樣古怪的細胞。然鵝，這還是頭一次正兒八經的線上營業。第一次寫帖，有點惶恐，畢竟我不是辣麼擅長文字。網上關於細胞培養的帖子也很多，在這裡我就拋磚引玉，下面幾點拙見，供大家掰扯掰扯。
細胞培養，首先得有一個細胞房，和其他試驗區分開的一個獨立區域（當然如果條件有限，也只能做到相對獨立，這時對個人的操作習慣要求就更高了）。基本配備包括：
01設備
潔淨臺（最好是生物安全櫃，如果條件允許的話），離心機，水浴鍋，二氧化碳培養箱，顯微鏡，移液器等
02物料
專用的實驗服，戴口罩，頭套，帽子，手套等
Tips：物料需要提前進行酒精消毒
在準備開始著手培養細胞時，建議先登錄ATCC官網查下細胞屬性或者找給你細胞的師兄師姐了解清楚：貼壁還是懸浮，最適培養基是什麼，推薦血清濃度，倍增時間等。
了解清楚之後，需要提前準備好細胞培養所需要的試劑耗材。所有的試劑除非是商品化無菌，其他的都需要高壓滅菌/過濾除菌（本人比較懶，大部分都是過濾除菌。為了安全起見，新配置的培養基我每次都會過濾的。）
如果細胞比較珍貴，剛開始培養，還沒有種子的時候建議用0.1um的濾器，可以去除支原體。不過，這真是一個費力活。等有存量之後，就可直接選擇0.2um過濾除菌。配製好的培養基建議根據細胞培養的規模來進行分裝，以免操作不當把整瓶培養基都汙染了。
凍存復甦的原則想必大家都知道，慢凍速溶嘛~
首先凍存，一般凍存液為10%DMSO，FBS的成分就跟據你富有程度或者細胞的嬌貴程度了，你要是不介意血清浪費，那就上90%的血清。不過大部分是40-50%的血清，剩下就是培養基來補了。
凍存密度，對於普通的細胞系，0.5-1x10^7/ml都可以。凍存液配製好先4度預冷，常溫情況下DMSO對細胞的毒害程度比低溫要大。凍存的細胞放在預冷的凍存盒（程序降溫盒，保證凍存溫度梯度下降），然後轉移到-80度（過夜），最後轉移到液氮罐長期保存。
對於復甦，溫度37度和42度都可以，曾經做過原代免疫細胞的溫度對比，影響不大。這裡有個小重點，離心後的細胞沉澱，先用手把沉澱拍散比直接用移液器吹打重懸會好很多。原因很簡單，剛復甦的細胞比較脆弱，直接吹打相當於你直接把抱在一起的細胞拆開，那難免會有傷亡惹。另外，對於剛復甦的細胞，不推薦加抗生素，因為細胞才剛從液氮裡面出來，細胞膜還比較脆弱，需要休息，可以過夜再加抗生素。
對於新手來說，快速掌握細胞培養的方法就是多觀察，當然不是每天看個幾遍，而是每天都要觀察。剛復甦的細胞，一般隔天處理。
對於貼壁細胞，如果復甦之後狀態不好，可以直接把培養基吸走再補新的，同時把那些不能貼壁的細胞去掉。但是，如果2兩天了，細胞一點都沒有貼壁，或者僅有一小部分貼壁，你需要取一些細胞出來做個臺盤藍染色，看細胞是否還活著。如果還活著你可以增加一點血清，再耐心的等待幾天。當然，如果這個細胞你多的是，那可以丟了重新復甦。
對於懸浮細胞，如果復甦後兩天了細胞狀態還很差，這時你可以考慮離心換新鮮培養基，同時去除一些死細胞，然後把細胞轉到更小一點的培養皿中，讓細胞之間多一點接觸。對於細懸浮細胞培養而言，細胞密度對細胞狀態影響很大，不能讓細胞覺得「孤獨」，也不能讓它覺得太擁擠。若是過兩天細胞還是不長，而這個細胞又比較重要，那麼只能再增加血清濃度試試（20%），或者換更好的血清，gibco的血清應該是目前血清中很好的了。
首先，細胞凍存要選擇狀態好的時候，比如剛開始傳代的幾次的細胞，傳3-5次一般，活率>90%，越往後培養，細胞的狀態會越差。
其次，儘量在培養的過程中不要讓細胞長過了。長過的意思就是貼壁的細胞在培養皿裡面都鋪滿了，細胞都被擠得變形了，培養基黃了，對懸浮細胞來說最明顯的就是培養基黃了。這些容易加速細胞的」老化「，而且細胞分泌的毒害物質會更多，會導致後續細胞狀態越來越差。
最後，當細胞狀態不好的時候，要多照顧一下它們。比如說發現很多細胞碎片，很多死細胞，可以通過低速離心去掉，同時給它們換個新的培養皿，增加一下細胞密度等等。你對它們多好，它們就表現得多好，對細胞需要像對孩子一樣。
細胞汙染這個事情，說實話每個養細胞的人都或多或少遇到過，支原體，黴菌，細菌。。。。。。細菌汙染，肉眼可見，培養基渾濁，顯微鏡下一看，會看到密密麻麻的生物小可愛。當然這已經是比較嚴重的，基本要放棄治療了。
01 黴菌，長條的，有細絲，如果細胞裡很多這種長長的細絲，那怕是藥丸，基本沒救了。
02 支原體也是雷區，因為觀察不到它的存在，但是你的細胞肉眼可見的不長個兒。我這顆老母親的心真是要涼涼了。用上3周的抗生素，漸漸長勢喜人。
在細胞汙染的初期，可以通過用培養基/PBS多次（3-5次）離心清洗，培養加抗生素挽救回來。那麼問題來了，如何避免汙染呢？配製好的培養基，試劑，0.22um過濾再使用，也不要多人共用。在操作的時候，要注意細節，記得：千萬不要把你的爪爪在任何開著蓋子的器皿上方經過，不然感染的嗶嗶der。為了避免犯規，要把打開的蓋子、試劑瓶、培養瓶果斷放在自己夠不著的地方。
個人衛生也是原罪啊，不要從公共實驗室搗鼓完大腸桿菌君，酵母君，就直接去照顧細胞君。畢竟我躺過槍，哭唧唧。建議進潔淨臺操作前，先用酒精把自己手肘以下和物料都噴一遍，，，噴香水的感jio
未完待續，請筒子們吃下這枚安利吧，萬望輕拍，手下留情~