單細胞拉曼分選儀(RACS):探索微觀世界的利器

馬波*，籍月彤，劉陽，徐健*

　　摘要：

　　單個細胞是地球上生命活動的基本單元，單細胞精度的科學研究能夠揭示生命科學的本質問題，已經成為國際研究熱點。拉曼激活細胞分選(Raman-activated Cell Sorting，RACS)能夠利用「單細胞拉曼圖譜」這一細胞內在、免外源標記的「生化指紋」進行功能分選，突破「細胞功能異質性原理」、「大多微生物尚難培養」等共性科學問題與重大技術屏障。本文介紹了拉曼光譜在單細胞功能識別方面的研究進展，詳述了基於拉曼光譜的單細胞分選技術和核心器件研製的產業化過程。同時，介紹了近期推出的第一代商品化的RACS儀器，並且討論了這些國產儀器裝備為醫藥、海洋、土壤/環境、工業生物技術領域提供的原創解決方案。這些擁有自主智慧財產權的國產高端儀器裝備將廣泛服務於工業過程在線實時監控、細胞工廠篩選、工業/土壤/海洋種質資源挖掘、臨床精準用藥及新能源開發等。

　　關鍵詞：拉曼組，單細胞表型組，拉曼激活細胞分選，國產儀器裝備，單細胞分選技術與核心器件

　　單個細胞是地球上生命活動的基本單元，因此單個細胞精度的生命系統研究能夠揭示「細胞功能異質性機制」這一生命科學的本質問題¹。傳統的、基於細胞群體水平性狀測量的信息並不能真實反映細胞內部的生物過程及機制^2,3，這是因為，在細胞種群中，即使是基因組信息完全一致的不同單個細胞之間，其表型也具有極為顯著的差異，而這些差異往往具有重要的生物學意義^4,5。因此，單個細胞的研究能夠帶來生物技術在能源、環境、健康、農業、海洋等廣泛應用領域的突破。2018年，利用單細胞測序技術完成的胚胎發育初期單細胞命運追蹤被Science雜誌評為2018年最重要的十大科學進展之首。近兩年來，世界頂級學術期刊《科學》《自然》分別有43篇和38篇文章聚焦於單細胞分析。

　　(一)拉曼組技術是單細胞功能識別的創新工具和有力武器。

　　自上個世紀以來，研究人員主要通過螢光標記與流式細胞術的結合實現單細胞功能分選，即螢光激活細胞分選(Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS)⁶。然而，FACS一般需要針對特定的生物標識物對細胞外加螢光標記，因此在單細胞分選方面存在如下瓶頸：(1)細胞適用性有限。不論在幹細胞發育的機理研究、腫瘤細胞的診斷，還是微生物群落中功能組分的識別中，關鍵的細胞表型經常僅有粗放認識或完全未知(即「未知」的細胞表型)，也沒有其生物標記。因此，FACS通常難以分選那些生物標識物通常未知或難以外加活體螢光標記的細胞體系(如微生物群落等)。(2)難以開展「原位」研究。進入細胞的螢光標記經常會改變細胞的原位狀態，有時甚至影響細胞活性，因此該方法通常僅限於能夠進行外加螢光標記的細胞，而且難以進行真正意義上的「原位」研究。(3)難以獲取全方位的代謝表型。FACS在單位時間只能獲得與區分很有限的細胞信息數據，如形態、折光率、反射率或螢光強度等有限指標，難以表徵單細胞全方位的「代謝表型組」，因此通常不易獲得尚難培養微生物與其生態功能之間的原位聯繫。

　　拉曼光譜是一種非標記的散射光譜，每個單細胞拉曼光譜由分別對應於一類化學鍵的超過1500個拉曼譜峰組成，反映了特定細胞內化學物質的成分及含量的多維信息。因此，特定時空狀態下一個細胞群體的單細胞拉曼光譜的集合稱為「拉曼組」⁷。由於細胞內化合物的組成對於細胞生理狀態和微環境的變化等因素敏感，因此單細胞拉曼圖譜或拉曼組不僅潛在能區分不同物種的細胞，還可以靜態或動態地表徵該細胞的生理狀態及所處微環境⁸。

　　業界研究表明，利用拉曼組可實現較為廣泛的細胞類型及功能的表徵⁸。例如，Forrester和Deng等分別利用拉曼光譜成功地對多株芽孢桿菌屬細菌的生化特性進行了鑑定，發現根據拉曼光譜信息可實現菌株水平的鑑定，並分析了各菌株之間可能的遺傳進化關係^9,10。在細胞功能識別方面，Samek和Singh等分別通過檢測拉曼圖譜分析了不同微藻的油脂產量，並建立了通過分析特定峰位比值來估測脂類不飽和度的方法^11,12。Heraud等通過檢測細胞拉曼圖譜，對微藻細胞所處的營養狀態(缺氮與否)進行判別和預測¹³。在臨床方面，2011年Dochow等通過微流控晶片結合拉曼光鑷技術，成功對人體白細胞、紅細胞、急性髓性白血病細胞以及兩種乳腺癌細胞進行了鑑別¹⁴。利用癌細胞的生化表型與正常細胞的區別，Barman¹⁵, Surmacki¹⁶和Haka¹⁷分別獨立地證實了單細胞拉曼可用於乳腺癌早期診斷。此外，中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞中心等也證明，單細胞拉曼光譜可以區分或定量表徵細菌細胞的種系發生¹⁸、藥物應激反應與耐藥性^19,20、分解代謝(綜合細胞代謝活性²¹、分解特定底物的活性²²)、合成代謝(甘油三酯含量及油脂飽和度^23,24、澱粉含量²⁵)、不同物種之間的代謝互作²⁶等。

　　(二)基於拉曼光譜的單細胞分選技術和核心器件是單細胞組學研究獲得突破性進展的關鍵。

　　拉曼激活細胞分選(Raman-activated Cell Sorting，RACS)能夠利用「單細胞拉曼圖譜」這一細胞內在、免外源標記的「生化指紋」進行功能分選，建立單細胞功能表徵和單細胞組學分析之間的橋梁，突破「細胞功能異質性原理」、「大多微生物尚難培養」等共性科學問題與重大技術瓶頸^27,28。隨著微流控技術的進步，一系列基於拉曼光譜的單細胞分選技術和核心器件先後面世，其中包括在靜止或者相對靜止系統中進行的拉曼光鑷分選^21,29,30、單細胞拉曼彈射分選(RACE)^18,31和拉曼激活光鑷重力驅動微液滴分選技術(RAGE)³²，以及在液相流動態細胞中進行的拉曼激活微流分選(RAMS)³³、拉曼激活單細胞微液滴流式分選(RADS)³⁴、介電遲滯拉曼激活單細胞微液滴流式分選(pDEP-RADS)。

　　RACE適用於靜置或貼壁細胞的單細胞分選。該技術在風乾的晶片上對細胞逐一測量拉曼信號後，用脈衝雷射彈射出具有目標拉曼信號的細胞¹⁸。通過改進彈射基片材料，RACE可以在背向直接採集拉曼信號，降低了操作的繁瑣性並大幅提升了全流程的速度和通量³⁵;同時，「All-In-One」RACE晶片的面世，讓測量、彈射、細胞裂解與核酸擴增都在同一與空氣隔絕的封閉體系內進行，從而降低了環境DNA對目標單細胞核酸擴增的汙染³⁵。近期油相震蕩乳化單細胞MDA方法的開發，使RACE分離的純培養E. coli（每個MDA體系含5個細胞）基因組覆蓋度由通常的<20%提高到50%以上³¹。

　　RACE在乾片上、利用高強度脈衝雷射彈射細胞，不僅細胞活性無法保持，而且雷射對細胞的損傷造成分選後單細胞鳥槍測序覆蓋率極低(通常低於10%)³⁵。最新發表的RAGE通過耦合拉曼光鑷和液滴單細胞包裹，克服了單一光鑷力難以實現目標細胞脫離焦平面導出的問題，並通過耦合液滴微流控技術，完成了目標單細胞的精準分選和快速導出³²。同時，拉曼檢測於水相中進行，能最大限度地保持細胞生理活性，並能夠精確匹配每個細胞與之相對應的拉曼光譜表型，實現「所測即所得」³²。此外，分選後的單細胞已經包裹在油包水微液滴中，因此可直接耦合後續單細胞培養和組學分析。RAGE大幅提高了一個E. coli細胞的全基因組測序覆蓋率，可達99.5%以上³²。

　　RACE和RAGE均主要針對相對靜止狀態的細胞進行分選，因此通量均在數個細胞/每分鐘這一較低水平，難以繼續大幅提高²⁷。因此，為了提高拉曼分選的通量(同時保持細胞活性)，科研人員在液相中對流動態細胞進行拉曼測量與分選。例如，RAMS晶片集成了基於介電的單細胞捕獲釋放單元，能夠克服單細胞拉曼信號較弱這一先天性缺點，可實現高速「裸奔」狀態下單細胞的捕獲，從而完成高質量拉曼信號的獲取³³。

　　在此基礎上，通過液相拉曼測量後的細胞實時微液滴包裹及分選，RADS³⁴的分選通量與系統性均比RAMS有了明顯的提高。由於採用介電液滴分選技術，RADS系統是目前已報導工作中全譜分選通量最高的RACS系統，通量達數百個細胞每分鐘。除了流式拉曼分選通量的提高之外，RADS的特色是，液滴包裹不僅可以保護細胞免受分選過程中的損傷(針對雨生紅球藻中蝦青素含量的分選準確率達到95%以上，分選後細胞存活率達93%)，還能夠與分選後細胞的培養、DNA、RNA、蛋白等的提取與分析等無縫銜接³⁴。單細胞中心最新還研發了pDEP-RADS技術，它在高速液流中基於介電遲滯來精確捕獲細胞和採集單細胞拉曼信號，在保持通量的前提下大幅提高了拉曼檢測的靈敏度，從而實現了非共振拉曼峰(信號比共振拉曼峰弱1~3個數量級)的高通量流式分選。

　　(三)基於拉曼組原理以及微流控技術研發的單細胞拉曼分選儀器將助力單細胞分析的革命。

　　青島星賽生物科技有限公司依託於中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞中心的原創技術與智慧財產權，自主研發了一系列基於拉曼組原理的原創單細胞拉曼分選儀器裝備。

　　單細胞拉曼分選-測序耦合系統(Raman-Activated single-Cell Sorting; RACS-Seq)克服了單個細胞拉曼分離可靠性低、核酸擴增容易汙染、全基因組測序覆蓋度不均等關鍵技術難點，具備樣品預處理、顯微拉曼成像、RAGE/RADS拉曼分選、單細胞微液滴細胞裂解和核酸擴增、拉曼組分析軟體等功能，實現了單細胞功能檢測、分選、測序與培養之完整流程的儀器化。RACS-Seq帶有配套的RAGE、RADS、pDEP-RADS等晶片和相應試劑盒(環境樣品中微生物單細胞提取與製備、穩定同位素飼餵細胞、單細胞核酸裂解與擴增等)，能夠滿足不同實驗目的所需的單細胞識別、分選和測序文庫構建，並且適用於任何大於0.5 μm的細菌、古菌和真菌細胞(也適用於微藻、植物、動物及人體細胞)。

　　臨床單細胞拉曼藥敏快檢儀(Clinical Antimicrobial Susceptibility Test Ramanometry; CAST-R)是臨床樣品之病原鑑定、藥敏性表型測量及耐藥基因解析的一體化裝備。它基於重水飼餵單細胞拉曼光譜技術，不需分離培養而直接鑑定病原種類，並測量基於代謝活性抑制的藥敏性表型(及其在細胞之間的異質性)，全流程可在3小時內完成，將目前檢測時長縮短至1/10 ²⁰。進而通過單細胞微液滴光鑷拉曼分選與核酸擴增技術，完成低偏好性、高覆蓋度、與耐藥表型關聯的單細胞基因組測序。最新論文證明，該系統能從臨床菌群中直接、精準地獲取一個細菌細胞的藥敏表型及其完整基因組(以往未有先例) ³²。CAST-R在單個細菌細胞精度同時追蹤「藥敏表型-完整基因組」的獨特能力，預期將為臨床感染診斷和用藥、耐藥性傳播監控、微生態監控等提供新一代解決方案。

　　單細胞拉曼表型監測系統(Raman-Activated Phenotyping System; RAPS)是基於拉曼複合表型對細胞工廠進行單細胞水平高通量、低成本、非入侵式的快速表型監測裝備。現有發酵過程的監控方案存在三大問題：1)時間精度，目前只能通過離線方式對各表型分別進行測定，由於樣品處理和測量時間帶來的滯後性，使得微生物發酵過程的控制比一般的工業生產難度更大;2)表型精度，由於缺乏綜合表型表徵手段，只能通過胞外產物儘量刻畫細胞狀態;3)測量精度，現有表型的測量均基於群體水平大量細胞的平均性狀，在高壓、高濃、高密度、且營養物質不均一的發酵過程中，細胞之間的差異被累積並級聯放大，而群體水平的平均性狀掩蓋了這種差異的發生/發展和變化規律，無法反映細胞的真實狀態。RAPS克服了現有方法的滯後性、可檢測表型有限，以及無法反映細胞異質性等局限，為細胞工廠研究提供了一個高效、全景式的表型鑑定和過程監測方案。

　　模塊式單細胞微液滴分離系統(EasySort)是一款擁有自主智慧財產權的小型臺式儀器。它小巧靈活，操作簡便，能夠自由地與各種型號的顯微鏡搭配組裝，輕鬆將明場/螢光/拉曼顯微鏡升級為「所見即所分」、保持原位狀態與活性的細菌單細胞精準功能分選裝置。在顯微鏡的視野下，具特定表型的直徑大於0.5 μm的單細胞均能夠被迅速包裹成單液滴，並通過獨有的重力驅動專利技術迅速移動到孔板或者EP管中，對接下遊實驗。因其兼具超高的性價比、便攜的外形、靈活的適配度、簡易的用戶界面以及優秀的細胞活性保持等眾多優勢，EasySort將廣泛應用於各類單細胞的分離、分選、培養及測序實驗。

　　高通量流式拉曼分選儀(High-throughput RACS：FlowRACS)搭載了具自主智慧財產權的pDEP-RADS技術，通過在高速液流中基於介電遲滯來精確捕獲和採集單細胞拉曼信號，克服了單細胞拉曼分選的通量限制，以及微液滴對於拉曼表型鑑定的影響，巧妙地集成了單細胞拉曼信號採集與單細胞微液滴發生。同時它利用全光譜實時判別算法，實現了活體單細胞超高通量拉曼分選的高度自動化。

　　(四)原創國產單細胞拉曼分選裝備將服務於醫藥、土壤/環境、海洋和工業生物技術等廣闊領域。

　　上述介紹的這些擁有自主智慧財產權的原創儀器裝備已經支撐著臨床精準用藥、生物資源挖掘、環境微生態機制、細胞工廠篩選、工業過程監控等廣闊領域。

　　在醫藥領域，細菌耐藥性蔓延是臨床感染面臨的嚴重危機。當前基於培養原理的病原鑑定和藥敏儀器檢測一般需要花費2-3天。而CAST-R不再需要培養，而是基於重水標記單細胞拉曼光譜，在3小時之內即可完成針對代謝活性抑制的藥敏性實測，而且將具有耐藥表型的目標耐藥菌單細胞分離出來，直接耦合細菌單細胞基因組測序，實現了在單個細菌/真菌細胞的精度，挖掘耐藥基因及突變、追蹤病原傳播和考察耐藥微進化機制。利用CAST-R針對臨床尿液樣品的初步分析顯示，基於單細胞拉曼的菌株鑑定準確率達到93%，藥敏測試與培養法的一致性達到90%。同時，從臨床尿液樣本中直接識別和分選出耐受特定抗生素的臨床E. coli，並進行了精確到一個細菌細胞的全基因組測序，覆蓋度可達99.5%³²，保證了基因組上所有耐藥基因突變均得以全面、精確地揭示。

　　在海洋和土壤/環境領域，「99%的微生物難培養」、「異質性普遍存在」、「原位功能難以測量」等因素均對環境功能基因研究、種質資源挖掘、生態環境監測等提出了嚴峻的挑戰。藉助RACE技術，研究人員以中國黃海近海真光層的新鮮海水為模式，用¹³C-NaHCO₃飼餵其微生物組，然後通過測量海水拉曼組中各個單細胞拉曼圖譜上¹³C峰的動態特徵，分辨出在海水中活躍固定與代謝無機碳的單細胞群。同時，分選這些原位固碳單細胞群(30個細胞混合)並測定其DNA序列，可重構出基因組草圖³⁵。後續研究表明，利用搭載RAGE-Seq晶片的RACS-Seq系統，可以分選獲取海水中單個原位固定CO₂的目標細菌細胞，並且對1個細胞的基因組即可獲得超過95%的基因組覆蓋度。對於土壤樣品，則可以基於重水孵育、針對代謝活性進行菌群中功能細胞的識別、分選和測序，單個細胞的基因組覆蓋度可達90%。

　　在工業生物技術領域，新興的合成生物學需要對細胞工廠進行人工設計並構建具新功能的生物系統，從而建立藥物、材料或能源替代品等的生物製造途徑³⁶。其中細胞表型的測試篩選工作是合成生物技術發展的「限速步驟」之一。代謝物是細胞中基因表達的最終產物，因此對細胞代謝物組或代謝狀態的檢測是細胞功能檢測最直接有效的手段之一。利用RACS-Seq，可以快速、非侵入性、不須標記地以單個活體細胞中澱粉含量這一特定表型對萊茵衣藻和小球藻進行快速表型鑑定，為富含澱粉的種質資源選育提供了一種嶄新手段²⁵。在萊茵衣藻和微擬球藻中，利用RACS-Seq可針對單個細胞中澱粉、蛋白質、甘油三酯含量和脂質不飽和度等表型對目標細胞進行快速篩選²⁴。利用RACS-Seq，還能夠針對CO₂利用速率這一特定表型對海水中難培養微生物進行分選和測序，從而完成功能基因及種質資源挖掘³⁵。

　　此外，在酶活篩選方面，將未知功能的酶基因庫轉化入酵母底盤中，利用FlowRACS基於拉曼光譜、不需酵母培養和純化而直接識別和定量其單細胞精度的目標代謝物，進而高通量流式拉曼分選目標單細胞，並利用下遊測序快速識別其中表達的目標化合物合成酶。因此，FlowRACS大大節約了時間、耗材和人力的成本，可將酶的篩選效率提高100到1000倍。

　　總之，拉曼組和單細胞拉曼分選基於細胞本徵性的生化指紋圖譜來識別與分選特定「代謝表型組」的目標細胞，具有不需預知生物標識物、不需標記、非侵入性、可全景式識別細胞代謝表型等核心優勢⁸。因此，包括RACS-Seq，CAST-R，RAPS，EasySort以及FlowRACS等在內的單細胞分析儀器系列(青島星賽生物科技有限公司)，將在精準醫療、大健康、生物資源挖掘、生態監測、生物安全、工業生物技術等領域得以廣泛應用，同時為單細胞研究提供全新的科學思路、技術路線和儀器裝備。

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　　作者簡介：

　　徐健 中國科學院青島生物能源與過程所研究員、單細胞中心主任;山東省能源生物遺傳資源重點實驗室主任。2003年華盛頓大學計算機科學碩士和生物化學博士，2003-2004年華盛頓大學基因組科學和系統生物學中心博士後。2004-08年於華盛頓大學基因組研究院任基因組拼裝和分析團隊負責人。2008年入選中科院「百人計劃」並全職加入中科院青島生物能源與過程所。研究方向為單細胞分析儀器和大數據，及其在微生物組、合成生物學和生物安全等領域的應用。論文發表於Science, Cell Host Microbe, Sci Adv., Nature Commu.等130餘篇，被引用10000餘次(H-index 43)。獲青年拔尖、創新領軍人才、國家傑青基金、中國青年科技獎等支持。

　　馬波 中國科學院青島生物能源與過程所研究員、單細胞中心副主任;微流控系統團隊負責人。 2008 年獲中科院大連化物所分析化學專業博士學位。2008.6-2012.7先後在美國加州大學洛杉磯分校Crump 分子成像研究所和萊斯大學等研究機構從事博士後研究。2012年8月加入中科院青島生物能源與過程研究所。目前研究方向聚焦在基於微流控的單細胞分析技術、儀器及應用研究。論文發表於Sci Adv., Nature Commu. Small, Anal Chem., Lab on a Chip等30餘篇，申請單細胞技術相關發明專利二十餘項，已授權8項。

單細胞中心合影

　　中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞中心(徐健、馬波、籍月彤、劉陽 所在單位)簡介：中國科學院青島生物能源與過程研究所是由中國科學院、山東省人民政府、青島市人民政府於2006年7月啟動籌建，2009年11月30日通過共建三方驗收並納入中國科學院「知識創新工程」管理序列的國立科研機構。單細胞中心的核心使命是以基因組工程、工具酶開發、先進成像、微流控器件、大數據等為主要方法學支撐，圍繞細胞工廠構建、微生物組快檢及機制等領域的關鍵科學和技術瓶頸，開發單細胞分析、分選、測序與培養技術，研製與產業化單細胞分析儀器系列，從國產裝備的角度支撐單細胞大數據網絡和微生物組天網等原創大數據系統，服務於工業生物技術、大健康、海洋資源挖掘、環境保護與修復、生物安全等應用領域。

　　青島星賽生物科技有限公司(籍月彤所在單位)：青島星賽生物科技是一家專注於單細胞分析科研設備及臨床診斷儀器研發與產業化的創新型高新科技企業。竭誠為科學研究人員、工業生物技術人員、以及臨床工作者提供高效、可靠、一體化全方位的單細胞水平解決方案，著力打造國產高端生命科學儀器品牌。產品應用於工業過程監控、工業及海洋種質資源挖掘、臨床精準用藥、微生物組研究、生物安全及新能源開發等領域。