編譯 | 許語輝
近期，英國 Francis Crick研究所Charles Swanton與倫敦瑪麗女王大學Trevor Graham合作在Nature Reviews Genetics雜誌上發表了綜述文章Resolving genetic heterogeneity in cancer，探討了腫瘤的異質性以及進化模型，總結了二代測序在描繪腫瘤進化軌跡、輔助精準治療等中的應用。現全文編譯如下，以饗讀者！
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摘 要
癌症在很大程度上與克隆的變異速率、適應速率和生長速率的進化規則一致。二代測序已經提供了大多數癌症的遺傳變異全景圖，並且癌症基因組學方法也提供癌症時空演化模式上新的見解。癌症的克隆進化與物種進化相反，因為腫瘤細胞群有巨大的規模、染色體的不穩定性及其表型可塑性的潛力。腫瘤克隆進化是研究癌症進展和治療失敗的有力武器，也可以用於預測個體腫瘤的行為並支持相關治療策略。
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前 言
腫瘤由細胞亞群（亞克隆）組成，可以依據影響其表型的多種變異進行分類，這些變異包括單核苷酸變異（SNV），小的插入或缺失（indels），體細胞拷貝數變異（CNA）和結構變異（SV）。遺傳性瘤內異質性已在大多數癌症中得到證明，這些可作為研究克隆進化的基礎。
腫瘤克隆進化的生物學機制與無性繁殖物種進化的生物學機制相似：複製、遺傳變異、遺傳漂變、選擇和環境適應。
進化生物學中新達爾文合成論的核心是分子進化，也就是說，DNA序列水平的進化，這一點可以將孟德爾遺傳與達爾文適應性聯繫起來。分子進化與癌症有關，而基因組測序能了解體細胞進化的時空模式和基因組變異積累。
反過來，分子進化的核心理論是群體遺傳學，這是過去90年來用來描述進化的基本理論，該理論框架也可用來研究癌症的克隆進化。從根本上來說，癌症克隆進化動力學就是研究癌症亞群的時空相對頻率變異。
儘管癌症進化的某些特殊性使其與經典物種進化有所區別，但是經典進化理論仍可以很容易地理解癌症的發展。
在過去的5年中，許多基於二代測序的研究已經描述了各種癌症的克隆進化模式，並顯示出和臨床的相關性。
本文就對腫瘤進化的相關理論模型進行綜述，並列舉正確解釋基因組數據和推斷進化動力學需要注意的事項。此外，作者討論了腫瘤驅動因素之一的染色體不穩定性（CIN）與癌症進化尤其是轉移的相關性，以及對癌症進行進化分類的臨床價值。最後，作者討論了克隆進化在治療失敗中的作用。
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腫瘤進化模型
癌症會表現出驚人的複雜性並出現新的特徵。然而，這種複雜性是由進化過程中相當簡單的突變，遺傳漂變和選擇作用引起的，這些過程中涉及大量的互作因子（例如，單個病變組織內的數十億個癌細胞和周圍的腫瘤微環境）。腫瘤之所以出現不同的進化「模式」，這是由上述基本過程在不同環境中的不同因素組合共同作用的。換句話說，由於選擇壓力會隨著時間變化而變化，因此腫瘤演化方式也會隨之變化。本部分作者將討論選擇作用和不同的進化模式。
3.1 選擇
選擇是進化的關鍵動力，如果一個細胞世系比另一個更能適應環境，那麼會產生更多存活的後代並產生適應性。通常來說，正選擇是群體中某個譜系頻率增加的動力，可驅動腫瘤進展。負選擇，也稱之為純化選擇，是種群中適應性降低的細胞消亡的進化動力，也會通過去除有效的新抗原而影響腫瘤的進化。
但是，選擇並非任何時候都是奏效的。癌組織中突變和遺傳漂變不斷發生，其發生率取決於細胞分裂和種群動態，而選擇則取決於環境。例如，如果一個種群中所有小生存率都一樣，那麼缺乏正向選擇就意味著該種群的進化是中性的，只有突變和遺傳漂變在起作用。因此，腫瘤系統發育樹產生分枝並不總是意味著發生了克隆選擇，因為分支也是突變過程的天然產物。
選擇作用具有「修剪」腫瘤進化樹分枝的效果。另外，突變率本身也可以被選擇影響。較高的突變率可以快速實現遺傳多樣化，但也可能會增加擾亂癌症生長有害突變的速率。例如，過量的染色體不穩定（CIN）可能導致細胞自主性死亡。但是，適度的CIN可能在腫瘤進化上是有利的。
例如，在CIN的腫瘤細胞群進化過程中，複合物（APC / C；也稱為環體）的亞基中的突變被選擇會導致有絲分裂時間延長、染色體錯配抑制並減少過量的CIN。
基於數學模型的研究表明，在不斷增長的細胞群體中，突變體的表型會受到選擇，一方面隨機的正選擇會增加突變的細胞自身的適應性，另一方面有害突變會對其他細胞種群產生負面適應性。有些模型還表明，突變體表型會提高癌發生的效率，選擇會傾向於使癌症轉移和發展所必須的突變獲得變得更加容易。
3.2 分支進化
因為細胞分裂和突變會不斷產生新的差異，所以進化往往會傾向於分支進化。癌症分支型進化尤其如此，因為癌症通常具有突變表型。
原則上來說，在任何給定的時間點，腫瘤細胞群會包含不同的細胞世系。這些不同世系的細胞新生率和死亡率的隨機波動會導致遺傳漂變，一個世系比另一個世系產生更多的存活後代的話會產生偶然性的擴張。
遺傳漂變是產生中性進化的一種形式，因為所有細胞世系產生存活後代的機會都是對等的。但是，假設沒有其他限制因子影響細胞生長，當某個癌症亞克隆的適應性提高時，會因為選擇的存在而擴張，如某個癌症亞克隆的驅動基因產生突變。在同樣的腫瘤內發現平行進化的過程中，選擇作用也很明顯，不同的癌細胞世系中相同的癌症驅動基因中突變後導致亞克隆的平行擴張。
3.3 線性進化
線性進化假定隨著時間的推移，只有某一個細胞世系可以存活。但是，這並不意味著只會逐漸形成一個細胞世系。如果只有一個克隆能夠存活到採樣點，然後也被檢測到，那麼進化會呈現線性模式。但是，關於癌症線性進化的結論可能會受制於癌症樣本數量和二代測序技術的解析度。
3.4 中性進化
中性進化在細胞種群內存在無差異選擇的情況下發生。在發生適應性突變之前，細胞種群會遵循中性進化模式。當發生突變時，克隆清除就會啟動，該清除作用可能是完整的也可能是不完整的（就是突變的細胞可能部分或者全部消亡）。如果清除完成，並且種群中的所有細胞都進行了同樣的適應性突變，則進化動力將又恢復為中性。
3.5 間斷進化
間斷進化假定適應性進化迅速大爆發，而不是連續的漸進性適應。如果適應性突變是基因組的大尺度變異（例如染色體的丟失、獲得、易位或融合），則該適應性克隆被稱為「有希望的怪胎」。
與小尺度的突變相比，適應性克隆的基因組發生了非常顯著的變化，「有希望」是指突變具有較大可能的適應性。
間斷平衡學說是Eldredge和Gould於1970年代初首次提出的，用來描述物種進化的一種模型，其適應性發生在一個空間上被孤立的小生態位中，直到新適應的個體迅速從原生態位中擴張出來並穿過更廣泛的種群。
由於原來的生態位很小，逐漸適應的種群在擴張之前不太可能被採樣，因此小生態位種群適應性的擴張會打破總體種群的進化動態。
平衡是指表面上的克隆分化較長時間停滯，在此期間，適應的克隆在所有種群中以較低（可能還無法檢測到）的頻率持續存在。
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用基因組學推斷進化模式
儘管適應性的結果體現在表型上，但是在其起源環境中測量腫瘤細胞表型是極具挑戰的，取而代之的測量相關細胞基因表達之類的數據。這類數據能提供有用的信息，但是考慮到癌症轉錄組的複雜性和可塑性，以及腫瘤微環境中細胞對基因表達信號的貢獻，它們往往很難用進化來解釋。
這就是為什麼到目前為止，基因組圖譜（DNA水平）一直是研究癌症進化的首選工具的原因。但是，當作者嘗試通過研究基因型來了解表型時，有幾個主要問題需要注意，這些問題在分子進化領域已經存在了數十年。
其中最關鍵問題是，除了一些明顯的例外（例如對某些治療有耐藥性突變），癌症的基因型-表型一一對應的圖譜基本上是未知的。可想而知，確定腫瘤系統發育樹和潛在的適應性性狀直接的關係仍然十分困難。
4.1 混池/混合測序（Bulk Sequencing）
這裡的混池/混合測序是相對於單細胞測序而言的。混合測序，即對包含許多個細胞的樣品進行測序，這會對腫瘤進化的推論產生幹擾和阻礙。
由於一般測序深度（100-1,000X）比樣品中的細胞數（1000萬至10億個）小許多個數量級，因此混合測序只能測到給定癌症樣本的細胞中大多數存在的突變。癌細胞種群每增加一倍，種群中出現的新突變的頻率就會減半。
因此，7次加倍後，就無法通過100x測序檢測到新的突變，而經過10次加倍後，就無法通過1000 X測序深度檢測到新的突變。常規深度測序只能檢測到有限的克隆（數百至數千個細胞），因此這是Bulk測序目前存在比較大的問題。
基質細胞的汙染也會稀釋癌症等位基因的頻率。混合測序主要是測樣品中細胞的最近共同祖先（most recent common ancester）。混合樣品中的細胞越多，最近的共同祖先就越古老，進化樹中的分支也越短（在多區域混合樣品測序的情況下）。從數學上講，這種現象源於合併理論。
因此，同一個腫瘤類型，不同大小的樣本可以產生不同的腫瘤克隆結構特徵。
4.2 測序試驗的選擇
腫瘤突變分為乘客突變（passenger mutation）和驅動突變（driver mutation）。
相對處於正選擇之下的驅動突變而言，乘客突變相對豐富，在進化上是中性和非適應性的，這使得在驅動事件上「搭便車」的乘客突變提供區分不同功能克隆的遺傳標記。
更具體地說，譜系特有的乘客突變的數量可以度量該克隆的分子年齡。
等位變異頻率（VAF）決定了克隆的豐度，克隆之間共有的乘客突變比例反映了它們的祖先情況。有不同的測序策略供選擇（高深度的靶向panel，中等深度外顯子組或更低深度全基因組重測序）。高深度測序可以準確復原克隆頻率，全基因組範圍內檢測乘客突變可以鑑定不同克隆。
此外，由於深度更高的測序為癌症的進化研究提供了更長的時間尺度，因此不同測序方案選擇是在全基因組測序和深度靶向測序之間的一種權衡。
全基因組測序（深度較低）可以提供短時間和早期癌症的克隆結構和細節信息，而高深度靶向測序則提供了有限的克隆信息，但克隆發育時間範圍更大。
在此，作者更推薦測序深度更高，測序範圍更廣的測序策略。
4.3 等位的拷貝數變異校正
癌症克隆進化動力學的研究從根本上來說是研究克隆在空間和時間上的相對頻率。目前已經有許多生物信息學工具利用大量測序數據推斷克隆頻率，例如PyClone，SciClone和PhyloWGS。這些工具試圖識別出所有具有相同頻率的突變數據集，並將其分配給不同克隆。
這些工具對於利用混合測序的數據研究癌症的演化非常有用。但是，進行克隆鑑定需要許多先驗推理步驟，每個步驟都有引入錯誤的風險，這些錯誤隨後會通過分析加深。
結構變異（遺傳物質的丟失、增加和重排）在癌症基因組中很常見，並且會混淆突變頻率。因為結構變異通常會改變基因座的拷貝數，也會影響該基因座上任何SNV的相對頻率。因此，為了將SNV準確分配給克隆，有必要校正CNA的影響。
從理論上講，這很簡單———任何單個突變的細胞豐度是其頻率和拷貝數的乘積。但是，如果錯誤地推斷了等位基因拷貝數，則該CNA中的SNV將被縮放到錯誤的頻率中，可能會錯誤地定義為一個新克隆。
在腫瘤純度為50％的腫瘤樣本中，三分之一拷貝中SNV頻率與四分之一拷貝中SNV頻率之間的差異僅有約3％，中等深度測序很難檢測到這種差異（≈100×測序深度）。此外，錯誤可能源於該基因座拷貝數變異的推斷。
因此，等位基因拷貝數推斷產生的錯誤（在給定位置存在多少個拷貝數變異）和將SNV分配給拷貝數（多少個等位基因拷貝有該突變）產生的錯誤疊加在一起，產生錯誤的克隆系統發育樹，並輸出一個錯誤的克隆結果和具有誤導性的腫瘤克隆結構圖片。
僅考慮位於二倍體區域的SNV並利用「遺傳搭車」效應會對克隆鑑定有所幫助，但在高度非整倍體變異的基因組中，可能會存在捨棄大多數SNV後進行下遊進化分析的風險，從而導致亞克隆信號的缺失。需要特別注意的是，克隆識別是根據克隆的大量「搭便車」突變進行的，而不是根據驅動突變進行的。作者仍然需要更高解析度的數據（全基因組測序> 100 X深度）和改進的克隆分解方法，以便能夠有效處理誤差積累和定量的不確定性。
新興的長讀長和linked-read測序技術燃起了規避此類問題的希望，因為長讀長本質上是相位突變，直接揭示它們的等位基因identity。
4.4 單細胞測序
單細胞測序能替代混合測序進行腫瘤進化研究。從理論上講，對單個細胞進行測序可消除混合測序固有的時間偏倚，因為無論何時出現突變，被測序的細胞內所有遺傳突變均可被檢測到。
克隆鑑定也變得簡單，不用考慮校正等位基因拷貝數。
然而，由於噪聲水平和數據缺失，檢測單細胞中SNV仍然具有挑戰性。
合併多個細胞的信息可解決此問題，但是會丟失單細胞的解析度。相比之下，CNA可以在單個細胞中被可靠地識別。但是由於背景拷貝數變異（CNA）率仍未得到很好的定義，因此從這些數據中得出關於腫瘤時間演化動力學的推論並不容易。
總而言之，單細胞測序可以獲得可靠的CNA，因為對單個細胞進行測序意味著可以在選擇發生之前分析一些新生的細胞，增加對背景CNA突變率的理解。
對樣品組織較大的癌樣品進行單細胞測序可能會對許多處於「進化死胡同」並且不會對未來疾病發展做出貢獻的細胞進行測序。
只需對大量細胞進行測序就可以解決這個問題，而且還提供一種直接的方法來檢測和鑑定CNAs上的是否存在純化選擇，這些是通過混合測序無法實現的。
作者預計，隨著測序成本的持續下降，單細胞測序將成為未來研究腫瘤克隆進化的首選工具。
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檢測選擇作用
克隆選擇會驅動癌症的發展，因此，很自然地，人們對克隆的選擇性優勢的原因非常感興趣。
但是，檢測選擇作用面臨一些挑戰。有兩種廣泛的檢測選擇的方法：基於克隆頻率的方法；基於突變模式的方法。這兩種方法是互補的，結合起來使用更搭。
5.1 利用克隆頻率檢測選擇作用
廣義上來說，基於頻率的方法檢測選擇作用是指通過尋找比中性進化模式下預期的細胞世系豐度更高的世系。
具體是通過利用VAF（通常也稱為點頻率頻譜）的分布來實現，利用VAF替代樣本中細胞世系頻率。這種方法的好處在於，在混合均勻的群體中，中性進化的VAF分布是大家都知道的。
中性進化時突變數m（f）是等位基因頻率f的函數，遵循1 / f2分布。多區域採樣也可以用來測量克隆頻率；根據這些數據構建的系統進化樹中，對祖先克隆的選擇作用會導致其後代的數量不成比例。
除了以上的方法之外，還存在同時考慮來自多區域採樣的VAF分布的方法。
克隆豐度的縱向採樣提供了一種特別強大的檢測選擇作用的方法。相對於其他克隆而言，不成比例增長的克隆可能受到選擇。
然而，由於腫瘤組織的可及性，對實體瘤的縱向組織收集和時間分析變得困難重重。隨著測序技術的改進和成本的下降，作者預計對cfDNA的分析將有助於規避其中的一些挑戰。
基於頻率的方法檢測非中性進化的微小偏差（例如，來自1 / f2分布的偏差）能力有限。弱選擇（例如，約1％的相對選擇性優勢）作用只會導致克隆頻率緩慢而輕微的變化，中等深度測序可能都無法檢測到這些克隆。遭受弱選擇的克隆可能永遠都不會被檢測到，特別是如果它們出現的時間太晚，可能需要比人類一生更長的時間才能成為優勢克隆。
腫瘤的空間結構也會帶來新的問題：有可能全部被選定的樣品都是來自於同一個克隆，畢竟選擇作用是肉眼看不到的。此外，基於頻率的方法只能檢測總體中正在進行的差異化的選擇。一旦選定的克隆被接管並被固定，新的腫瘤細胞群就是同質的，此時，腫瘤內的進化恢復為中性進化。
在這種情況下，必須進行密集的縱向採樣才能準確檢測到選擇作用。因此，從單個低測序深度樣本中進行選擇作用的推斷有很大的風險。
5.2 利用突變pattern檢測選擇作用
選擇作用檢測的另一種方法是利用基因組中的突變負荷和突變類型，作者將它們統稱為「突變pattern」法。這些方法基於這樣一個事實：選擇會導致某些突變的比例升高，從而增加攜帶該突變克隆的適應性，這個特徵可以用來衡量細胞譜系分化程度。
確定腫瘤中癌症驅動突變的原理是確定癌症中發生突變的基因頻率與背景期望值的比值。dN / dS（非同義突變（N突變）與同義突變（S突變）比值）是一種主流的基於測序檢測選擇作用的方法。
該方法的內在邏輯是非同義突變將傾向於經歷過選擇，而同義突變在進化上將是中性的。
因此，正選擇將導致NS突變的比例升高（dN / dS> 1），而負選擇將導致NS突變降低（dN / dS <1）。驅動基因應具有高的dN / dS值，目前已經有專門針對癌症數據的改良dN / dS計算方法。
為了使dN / dS方法有效，必須在受選擇的基因或基因座中找到足夠數量的突變，以使該比率在統計學上顯著偏離1。因此，需要最小的突變負荷來計算該比值，該方法很難應用於基因突變太少的隊列研究中。
重要的是，dN / dS方法能估計整個患者群體中平均的受選擇強度，但是很難應用於個體腫瘤的進化動力中。少量經歷正選擇的患者不足以驅動整個隊列的dN / dS值的變化。群體結構也以複雜的方式影響著dN / dS，並使解釋選擇作用變得困難。
最後，將基於頻率的方法與基於突變pattern的方法相結合可以部分克服各自方法的局限性，從而提供更可靠的克隆選擇估計。
5.3 隨機性vs確定性
在癌症或者其他物種組成的小規模種群中，隨機性可以左右遭受強烈選擇的突變的進化關係，但是大群體中的大型克隆的進化不易受隨機性的影響。
由隨機進化轉變為確定性進化的克隆大小與突變體的選擇優勢成反比。這種從隨機性到確定性轉變的進化規則暗示癌症的進化具有可預測性：小的、隨機性進化的克隆進化模式不可預測，而大的克隆進化則具可預測性。
換句話說，作者能夠準確地預測已經生長到足以被檢測到的克隆的進化。
但是，準確預測特定的小的克隆的出現變得非常具挑戰性。
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腫瘤進化的染色體不穩定性（CIN）
6.1 CIN及克隆適應度
拷貝數變異對癌症基因組的影響比其他任何突變都要大，這為癌症進化提供潛在的適應性基礎。拷貝數變異是CIN的結果。
在有絲分裂期間，染色體分離過程中持續不斷的錯配以及DNA複製和修復過程中的持續不斷的錯誤會導致拷貝數的變異。最終結果是產生非整倍性變異，包括整條染色體非整倍性變異或者染色體某一部分的非整倍性變異。
單個染色體錯配事件也會導致非整倍性變異以及相關克隆的擴張，因此非整倍性也可以獨立於CIN而發生。這類腫瘤是同質性的非整倍體，而正遭受CIN的腫瘤是異源的或亞克隆性非整倍體。
此外，非整倍性變異也可能是由單個災難性事件引起的，這些事件被稱為一種複雜的染色體重排事件chromoplexy（如果影響多條染色體）或染色體碎裂（影響1-2條染色體），這類非整倍性變異與不同類型癌症的相關性越來越明顯。
非整倍性變異可以同時改變許多基因的體細胞拷貝數，進而引起相關基因表達的差異。儘管背景改變率在整個染色體上都有差異，但它不能解釋腫瘤中反覆出現的染色體水平或染色體臂水平畸變，但是這可能通過選擇作用來解釋。
腫瘤抑制基因和癌基因的位置囊括了不同癌症中觀察到的非整倍性變異模式，也展示出由CIN提供的適應性潛力。
在急性淋巴細胞白血病和肝癌的小鼠模型中，T細胞和肝細胞中誘導CIN導致腫瘤特異性的染色體拷貝變異，暗示選擇性壓力具有組織依賴性。
CIN還會導致通過手術進行根治性治療或通過靶向治療的癌症產生疾病逃逸（disease escape）。
在肺癌的KRAS模型中誘導CIN會導致癌症快速復發，復發的腫瘤表現出高水平的非整倍性變異，並且與原始的致癌因素刺激無關。
在慢性粒細胞白血病中，對靶向BCR-ABL的伊馬替尼治療產生抗藥性的患者會發生額外的染色體級別的變異。
CIN的某些效應與基因特異性變異無關，這些變異包括增殖減少，蛋白毒性應激，代謝變化，應激反應上調和進一步的基因組不穩定。額外的基因組不穩定性具有深遠的影響，因為非整倍體變異癌細胞會繼續產生更多的遺傳多樣性。
非整倍性（或CIN）既可能有害又可能有利的事實凸顯了選擇作用的重要性。這一點在酵母中得到了很好的闡述，非整倍性變異的酵母在嚴酷的環境下具有適應性優勢，作為「防禦的首道進化線」。
但是在環境恢復正常後，隔代遺傳後非整倍性變異卻消失了。在對小鼠胚胎成纖維細胞中非整倍性致癌潛力的系統研究中，三體性在任何條件下均無法誘導轉化。
與配對的整倍體細胞相比，三聚體的細胞生長較差，和適應性懲罰一致。但是，在長期生長過程中，三體細胞又獲得了額外的非整倍體變異，導致適應性提升。
作者認為，低水平的非整倍性變異可能對腫瘤具有保護作用，但在某些生長條件下，非整倍性變異的基因組不穩定效應可促進腫瘤生長。
因此，稀有的促進生長的非整倍性變異的極少數量細胞會不斷擴張並上升到克隆水平，而生長受抑制的非整倍性變異細胞被選擇後消除。
與這一觀點相一致的是，在環境壓力（如缺氧和化療）下，非整倍體變異的細胞的生長優於整倍體的細胞。添加單條染色體增加了細胞對環境壓力的耐受性，但是並不針對特定的染色體，這表明特定基因的過表達並不是提升適應性的唯一因素。
6.2 CIN和癌症轉移
癌細胞轉移和擴散需要多種表型的細胞類型，CIN產生的核型和表型異質性又能為產生這些細胞類型創造條件。基於配對的原發腫瘤-轉移腫瘤的比較研究表明，前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌的轉移性病灶中存在非整倍性變異的富集。
最近，利用配對的透明細胞腎細胞癌（ccRCC）原發性和轉移性腫瘤解析其克隆結構，結果顯示轉移性克隆與非轉移性克隆之間的關鍵區別是染色體非整倍性變異程度和染色體複雜性（chromosome complexity）。
此外，作者還觀察到特定的體細胞CNA變異（9p的缺失和14q的缺失）在轉移性克隆中高度富集，沒有證據表明小尺度的突變比如SNV受到選擇。
除了同時改變許多基因的表達外，促近癌細胞轉移的染色體級別變異的潛在機制還包括通過細胞間連接蛋白的表達的改變來誘導間質轉化，使用來源於染色體錯配的細胞質DNA激活cGAS-STING通路、以及免疫逃逸。
6.3 CIN和臨床預後
在許多回顧性研究中，CIN與不良臨床預後的關聯證明了CIN在癌症發展和進展中的作用。
最近，對早期非小細胞肺癌（NSCLC）克隆進化的前瞻性隊列分析表明，CIN會增加腫瘤復發和死亡的風險，而與某些已知的預測標記無關。
與NSCLC相似的透明細胞腎細胞癌（ccRCC）的前瞻性研究中，非整倍性變異的增加與較短的無進展生存期和總體生存率相關。
有趣的是，CIN水平與其對預後整體影響有關。在對超過2,000多個樣本的泛癌研究中，只有中等水平的CIN（> 25％和<75％）與存活率降低相關，先前也有一致的研究表明過量的CIN水平可以改善預後。
這些結果與CIN適應性成本一致，過高的非整倍性變異水平使具有異質性的核型喪失選擇性優勢。
CIN還與化療和腫瘤免疫治療的耐藥性相關。在非小細胞肺癌（NSCLC）中，CIN會導致編碼人白細胞抗原（HLA）的基因的亞克隆雜合性（LOH）丟失，並在腫瘤中發現雜合性丟失存在正選擇。這篇文章還發現，人白細胞抗原LOH事件有利於亞克隆新抗原的積累並使克隆進一步進化。
在ccRCC中，作者觀察到HLA LOH的比率在原發性腫瘤亞克隆中增加，在腫瘤轉移病灶中受到選擇，再次強調了免疫逃避在腫瘤轉移中的作用。
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進化模式和患者預後
在精準醫療的背景下，了解腫瘤的進化軌跡和進化潛力是否可以幫助預測患者的預後仍然是一個關鍵問題。
7.1 克隆多樣性和臨床預後
克隆多樣性（中性和非中性）能使腫瘤從容面對適應治療帶來的選擇壓力，也有利於腫瘤適應腫瘤環境或遠端轉移性定植。
在一項Barrett食管（一種癌變前疾病）的前瞻性研究中，疾病發展為腺癌的進程與克隆多樣性相關，而與其他遺傳風險因素無關。
慢性淋巴細胞性白血病、頭頸癌、卵巢癌和其他癌症類型中，亞克隆多樣化與不良臨床預後之間存在關聯。CNA和驅動突變的亞克隆多樣化與ccRCC不良的預後相關，與無進展和總體生存率降低獨立相關。
在NSCLC中，體細胞CNA的多樣性與復發和死亡的風險相關，體細胞SNV與復發和死亡風險無關。
在乳腺癌的患者中，腫瘤內HER2（也稱為ERBB2）拷貝數的異質性與較短的生存期相關。
在多發性骨髓瘤中，中性進化與無進展生存期和總體生存率相關，並且與優勢克隆的致癌驅動因子有關。
7.2 間斷進化vs漸進進化和臨床表型
越來越多的證據顯示，有些腫瘤在短期內會獲得多個和/或強的驅動突變（間斷進化），而另一些研究則顯示驅動突變獲得是穩定的（漸進進化）。
間斷進化的結果是快速的克隆清除並形成功能上均一的腫瘤組織。
在ccRCC中，這些腫瘤組織具有低驅動突變瘤內異質性和高水平的克隆非整倍性變異特徵，這些非整倍性變異在腫瘤發展的早期就已被選擇所固定。此類腫瘤的增殖速度更快，能迅速擴散到許多不同的位置。與克隆多樣性和亞克隆非整倍性變異的腫瘤相比，此類克隆的腫瘤預後更差。
原發部位快速進化的腫瘤中，相同的優勢克隆播種形成轉移瘤，使未經治療的患者產生有限的轉移瘤內異質性。相比之下，具有亞克隆非整倍性變異的腫瘤以達爾文方式進化並逐漸積累驅動突變，腫瘤組織生長的速度較慢且持續時間較長。
在某些情況下，轉移瘤是由多個克隆播種的，進而導致轉移瘤內有較高的異質性（在未經治療的患者中）。與這一發現一致的是，一項腫瘤轉移形成的數學模型研究表明當原發性腫瘤生長緩慢時，觀察到轉移瘤內異質性的增加（原發性腫瘤中不同克隆播種到不同轉移部位的結果）。
有趣的是，逐漸進化的腫瘤也與轉移進展的一種稱為寡轉移（oligometastases）的特定模式有關。
寡轉移僅局限於單個部位的少數病變，處於轉移能力強和弱的中間狀態（具有重要的臨床意義）。不同腫瘤無性系轉移效率降低可能原因是克隆幹擾（原發性腫瘤部位的克隆間競爭）或克隆驅動力弱，此時亞克隆驅動事件發生為腫瘤轉移提供了額外的可能性。
多數胰腺癌逐步獲得驅動突變事件，呈現出漸進式的進化模式。然而，某些胰腺癌通過一次災難性事件獲得多個驅動突變事件，導致複雜的基因組重排，最終表現出間斷的平衡。
腎癌中的觀察一致的結果，這種進化軌跡導致轉移瘤內較低的異質性，因為所有轉移都是由原發性腫瘤中優勢克隆播種的。
另一個例子是葡萄膜黑色素瘤，具有強侵襲性，會發生潛在的肝轉移，特別是原發性腫瘤帶有BAP1突變的患者中。 BAP1突變和染色體複雜性變異在腫瘤發生的早期短暫爆發，暗示癌症發展的最早階段就已經獲得了轉移潛力。
在三陰性乳腺癌中也觀察到類似的結果；在前列腺癌和結直腸癌中，染色體複雜變異和染色體碎裂會發生渦輪增壓式進化。
最後，腫瘤進化過程中突變獲得的時間順序會影響骨髓增生性腫瘤，ccRCC，NSCLC和乳腺癌的臨床表型和預後，這是進化受到限制的證據。
癌症中廣泛的進化模式會導致各種臨床的表型和不同預後。尤其是，基因組間斷進化模式凸顯了管理早期獲得轉移能力的癌症需要面臨的挑戰。
臨床前模型表明在組織學檢測到惡性腫瘤之前，腫瘤已經出現了轉移性擴散。這些觀察結果與癌症篩查方法相關。
由於侵入性克隆的出現與癌轉移擴散之間的潛伏期很短，因此早期檢測腫瘤的窗口期可能非常短暫。
腫瘤進化軌跡仍然存在許多問題，包括有利於漸進進化（逐漸積累驅動突變）或間斷進化（基因組的大規模重排導致很快獲得許多驅動突變）的環境條件，以及如何改變這些環境以獲得好的治療效果。
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對治療產生抗性的克隆起源
儘管在癌症的治療方面作者已經取得了持續的進步，但轉移性腫瘤仍基本上無法治癒。理解在選擇的治療壓力下癌細胞的抗藥性如何進化，可以為延遲或預防耐藥性的出現提供新的策略。
8.1 對靶向治療的耐受性
在血液瘤和實體惡性腫瘤中，通過靶向致癌驅動基因的治療已給癌症治療領域帶來了顯著的變化。
典型的例子包括慢性粒細胞白血病中的BCR-ABL易位，使用伊馬替尼靶向治療可使患者10年生存率達到85％左右。
但是，除了慢性粒細胞白血病以外，其他癌症靶向藥物的疾病控制是相當短暫的。
實體瘤突變的複雜性可能是促成耐藥性的因素，因為任何一個突變都可能成為治療產生耐藥性的pathway。較高的腫瘤突變負荷（TMB）與EGFR抑制劑治療轉移性非小細胞肺腺癌（NSCLC）（EGFR突變）的療效縮短有關。雖然耐藥性突變可能從頭出現（de novo），但它們通常以次要克隆的形式存在。
但是，如前文所述，在預處理的樣品中檢測到次要克隆受限於採樣寬度和測序深度。腫瘤生長的模型表明，轉移性病變中可包含十個或更多個耐藥亞克隆。儘管這些模型存在一定局限性，但這些預測與臨床和基因組數據中的結果一致。
在一項最近發表的使用依魯替尼治療的慢性淋巴白血病患者的研究中，因BTK和/或PLCG2突變的產生耐藥性，這些突變在產生臨床進展前15個月就可以通過高靈敏度方法被檢測到，其中一些患者正發展多重抗性突變。
在其他類型的腫瘤中也有多克隆治療產生耐藥性的研究，結果表明在治療的選擇壓力下，克隆的平行擴張具有不同的耐藥機制。抗藥性克隆的早期評估還可以用於預測治療療效的長短，最近在轉移性結直腸癌中使用頻繁的時程液體活檢和數學建模證明了這一點。
因此，一個全面的耐藥性突變目錄可以為適當的組合治療策略提供參考，而動態監測新出現和正在治療的變異則可以促進適應性治療策略的落地。
這種想法已被用來指導結直腸癌中EGFR抑制劑治療措施，也被用在血液中RAS耐藥突變等位基因的蠟化和減弱的治療中。
這些結果還突出了與耐藥性突變相關的懲罰性適應問題：KRAS突變能在對EGFR抑制劑產生抗性的患者的cfDNA中檢測到；但是，當治療停止時，它們就無法檢測到，表明他們需要持續治療以維持其健康，而耐藥性就是持續治療的代價。
適應性成本越高，抗性克隆就越難出現，就像在PDX動物模型（對BRAF抑制劑產生抗性的具有BRAFV600E突變的黑色素瘤或NSCLC）中觀察到的那樣。
利用ERK（也被稱為MAPK）抑制劑（作用在BRAF的下遊）處理人源的異種移植瘤後，多個BRAF基因擴增的克隆被選擇且得到繁殖。當BRAF，MEK（也稱為MAPKK）和ERK抑制劑進行間歇性結合處理時，適應性劣勢阻止了攜帶BRAF擴增的亞克隆的出現。
最後，克隆的複雜性可能會影響靶向藥物自身。儘管骨幹變異導致頻繁的無性系繁殖，但是藥物的靶標也可以存在於腫瘤的亞克隆中。
最近的一項臨床試驗中，對FGFR抑制劑有響應的病人具有FGFR擴增變異克隆，而無響應者則具有亞克隆擴增。
8.2 免疫檢查點抑制（immune checkpoint inhibitors，CPIs）的耐受性
腫瘤治療的另一個重要發展是免疫檢查點阻斷。CPIs療效取決於免疫系統通過對腫瘤中新抗原的預先識別，這種新抗原是由腫瘤中積累的體細胞突變引起的。因此，CPIs療法在具有豐富的體細胞突變（即高的腫瘤突變負荷）的腫瘤類型中最有效，充足的突變增加了向免疫系統提供有效新抗原的可能性。
最初，人們期望CPIs可以繞開靶向治療所面臨的克隆多樣性難題。然而，克隆進化對免疫療法的成功與失敗有著深刻的影響。
亞克隆的新抗原不足以刺激產生腫瘤免疫反應，比如具有顯著亞克隆突變負荷的黑色素瘤和NSCLC瘤中檢查點阻斷的敏感性降低。其他類型的腫瘤中也證實了這種情況的存在。
新抗原進化或免疫編輯是對CPIs產生耐受性的原因。有報導指出，在CPIs治療的選擇壓力下，克隆和亞克隆中的新抗原均有丟失。染色體中相關區域的刪除使該克隆中的新抗原丟失，而亞克隆中新抗原則通過某些亞克隆增生而丟失。非常重要的是，丟失的新抗原能產生肽段，會引起自體的T細胞擴增，表明它們產生了功能性免疫應答。
抗原呈遞的失活是產生CPIs耐受性產生的另一個重要機制。失活的因素包括，B2M（編碼主要組織相容性複合物I類抗原呈遞的基本組分）以及編碼幹擾素受體相關的Janus激酶1（JAK1）或JAK2的基因中的點突變，缺失突變或者LOH。
像對靶向治療有耐受性的驅動突變一樣，這些突變在治療中被選擇並產生擴張。疫苗策略也容易產生耐藥性進化。
在基於RNA的針對多種癌症突變的疫苗試驗中，有一名患者中證實了新表位特異性殺傷，該患者最初有反應，但是由於缺乏β2-微球蛋白導致黑色素瘤細胞的生長而產生了耐藥性。
免疫逃避的另一種機制是HLA突變或丟失的腫瘤細胞群被選擇。在最近的一項KRAS突變結直腸患研究中，轉移反應性的T細胞識別腫瘤所需的HLA基因有缺失。
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結 語
對癌症進化動力學的理解可能會改善臨床的預後，因為這將使精準地預測預後並應用「進化的視角」管理患者成為可能。基因組分析能對腫瘤進化動力和進化潛力進行定量分析。對迅速增長的癌症基因組資料庫進行分析仍然具有巨大的價值，相互比較大量不同的癌症樣本之間進化動力可以獲得新的見解。
但是作者警告：這些結論嚴格受限於基於單活檢的大批量測序數據集。隨著測序成本的持續下降，更高深度的測序（例如超過100 X的重測序）將可以更準確地鑑定腫瘤克隆，降低從這些數據中得出的錯誤結論的概率，並可以解析較小數量的克隆。
單細胞測序技術可以避免混合測序數據的複雜性，而這一逐漸成熟的技術有望同時測定單個細胞中的基因型和表型，並對其原位微環境進行鑑定。
癌症樣本可獲得性是研究癌症進化動力的瓶頸。作者希望諸如TRACERx153和PEACE154研究的舉措能變得更加的普遍，這些研究能夠為腫瘤樣本的採集提供基礎設施。即使在單個時間點，這些研究也比單腫瘤活檢樣本具有更好的代表性，單腫瘤活檢樣本不足以代表腫瘤的全部，存在克隆被錯誤鑑定的風險。
液體活檢樣品的定量基因組分析（分析外周血樣品中的腫瘤DNA）可能會克服這個問題，並為微創縱向疾病監測和對疾病進程和治療響應的預測提供一條可行的途徑。總而言之，基因組進化為揭示癌症克隆動態並影響患者預後提供了一個不斷改進的視角。
譯者簡介
許語輝博士，聯川生物DNA重測序線高級產品經理，主攻方向為腫瘤克隆異質性與進化，擅長從進化生物學的角度來闡釋腫瘤免疫逃逸與耐藥等科學問題。
https://www.nature.com/articles/s41576-019-0114-6
製版人：嘉