DNA聚合酶純化工藝過程

2021-02-15 生物製藥合伙人


肝素（Heparin）是一種天然產生的粘多糖，以此形式作為一個親和配基和離子交換配基作用於寬範圍的生物分子，包括凝血因子、其他血漿蛋白質、脂蛋白、蛋白質合成因子以及對核酸和類固醇受體作用的酶類。

將肝素固定在瓊脂糖微球上製備的Heparin Sepharose 6FF，也可以用來純化DNA聚合酶，低鹽上樣，高鹽洗脫，洗脫後酶液可通過透析，超濾或者Focudex G-25凝膠過濾的方式除鹽。

Heparin Sepharose 6FF使用方法

平衡：用5-10CV的平衡緩衝液（20-50 mM PB或Tris/HCl，pH 7.4-8.0平衡層析柱，至流出液電導和pH不變（與平衡液一致）。 

上樣：樣品緩衝液應儘可能與平衡液一致。固體樣品可用平衡液溶解配製；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或微濾處理。

淋洗：上樣完畢後繼續用平衡緩衝液淋洗至基線。   洗脫：用洗脫緩衝液（20-50 mM PB或Tris/HCl+1-2 M KCl，pH 7.4-8.0，KCl濃度需要根據目標蛋白的結合力進行適當調整）洗脫，收集流出液。可採用線性梯度或階越式梯度洗脫。     

原位清洗：為了避免不同樣品間的相互幹擾，或者當介質汙染比較嚴重時（反壓增加），需要對介質進行在位清洗。 

（1）對於以離子鍵結合的蛋白，可用2-3 CV以上的2 M NaCl清洗，並用3 CV以上的純水衝洗。 （2）對沉澱或變性蛋白蛋白，可用0.1 M NaOH清洗（1-2 h），並用3-10 CV平衡液和3 CV以上的純水衝洗。也可用6 M Gua-HCl或8M urea清洗（0.5-1 h） 

（3）對疏水性結合的蛋白，可用0.1-0.5%的非離子去汙劑清洗（1-2 h），並用3-10 CV的純水衝洗。 其它注意事項：在裝柱、使用和保存柱子的時候，要避免柱子流幹，氣泡進入。

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