開始純化蛋白前應先製備初始樣品。真正進行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。雖然後基因組學領域的研究者很少使用原始組織純化蛋白，但當研究者想要關聯某一蛋白序列的催化活性時，會有這樣的需求。
當前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質。一些重要決定需要提前考慮以便優化後續的純化。研究者需要考慮蛋白質的最終用途（例如酶測定，結構研究，抗體生成），因為這將決定最終蛋白質製備所需的量和純度。儘管蛋白質表達的詳細討論超出本文範圍，但是在這一點上仍有幾個值得考慮的基本點，因為它們直接影響後續的蛋白純化。
哪個系統的表達水平最高？一般規則是，表達水平越高，越容易獲得大量高度純化蛋白。
1.如果選擇大腸桿菌表達系統，最終目的可溶性表達或不可溶表達是包涵體形式嗎？ 由於包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨後包涵體中再摺疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的最終產量相平衡 。已經有許多工作優化了從包涵體中產生功能蛋白的產量 。
2.另一個考慮是是否靶向胞內或胞外（分泌的）表達。胞內表達需要將蛋白質從大量宿主細胞蛋白中純化而來。相比之下，特別是當宿主細胞在無血清條件下生長時 ，目標蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來。
無論目標蛋白的來源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的製備很重要。同時也需要考慮表達和純化策略。
樣品的製備
目標蛋白的胞外分泌可使用簡單快速親和純化方案 ；所需的唯一樣品製備可能需要傾倒貼壁細胞的條件培養基或者低速離心以去除懸浮細胞。當然，製備過程的第一步色譜層析時可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調節pH，但這些步驟簡單易行。然而，如果第一步純化樣品步驟進行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當處理大量條件培養基時可能會有技術難度；根據培養基的脫鹽體積常可採用透析或錯流過濾。
如果靶蛋白在胞內表達，則細胞首先需要通過離心獲取，然後用合適的裂解緩衝液重懸。如上所述，裂解緩衝液需要包含合適的緩衝液和其它添加劑以確保靶蛋白的最大穩定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時的緩衝液交換步驟，則樣品/裂解緩衝液的組成也需與隨後的純化步驟相適宜。
接下來，需要有效的細胞裂解方法。文獻中已經描述了各種方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（儘管這種方法不容易規模化），超聲或基於洗滌劑的裂解（有很多商業裂解試劑）。通過向裂解緩衝液中加入溶菌酶可以改善基於洗滌劑的裂解效率。基於洗滌劑的裂解非常溫和，且不導致細菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產生具有良好流動特性的樣品，通常需要加入含DNA酶 。
哺乳動物和昆蟲細胞也可以通過超聲或基於洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度 。
一旦細胞（微生物/昆蟲/哺乳動物）被裂解，通常需要離心除去細胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用於靶蛋白的柱色譜層析純化。