北京大學張澤民課題組發表關於單細胞測序刻畫肝癌免疫微環境動態...

北京大學生命科學學院、北京未來基因診斷高精尖創新中心（ICG）、生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）張澤民課題組、首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院彭吉潤課題組以及德國藥企勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）公司腫瘤免疫與免疫調節部門多位科學家，在國際期刊Cell上發表了題為Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma（單細胞測序刻畫肝癌免疫圖譜與動態變化的研究）的研究論文，結合10x Genomics和SMART-seq2單細胞RNA測序技術，對肝癌患者多個組織的免疫細胞做出了系統性的刻畫，分析了免疫細胞動態遷移和狀態轉化的特徵，描繪了腫瘤浸潤免疫細胞跨組織的動態過程，探索了它們在肝癌治療上的潛在價值。

肝細胞癌是世界範圍內死亡率排名第三的癌症，其中中國的肝癌發病率居世界之首[1]。免疫逃逸被認為是癌症發展的標誌之一，目前研究表明，腫瘤存在多種免疫逃逸機制，提出了研究腫瘤微環境中不同免疫細胞狀態的重要性[2]。而不同類型的單細胞測序技術則是研究不同類型免疫細胞的狀態和動態的有力手段。

北京大學BIPOIC張澤民教授 圖片來源：BIPOIC

該研究課題組組長北京大學BIPOIC張澤民教授表示：「癌症免疫療法是近年新興的治療方法，逐漸成為癌症治療領域的新趨勢，被認為是能夠徹底治癒惡性腫瘤的希望所在。北京大學很高興能與北京世紀壇醫院和勃林格殷格翰三方一起合作，共同研究肝癌微環境中不同免疫細胞的狀態，在單細胞水平上描繪肝癌免疫微環境的動態特徵，為更多的肝癌患者帶來希望。」

勃林格殷格翰腫瘤免疫與免疫調節部門執行總監Emily Corse博士和資深主任科學家劉康博士表示：「這份令人興奮的工作成果得益於三方的深入、高效、愉快的合作模式。這次全球合作迸發出對肝癌的免疫微環境的重要新洞見，揭示了免疫細胞在腫瘤微環境和其他免疫組織之間的動態遷移變化。這份結合前沿的生信分析技術和生物學驗證手段的工作還暗示了免疫細胞遷移理念也適用於其他腫瘤類型的可能性。」

關於單細胞測序刻畫肝癌免疫圖譜的研究

【研究思路】

目前單細胞測序技術已經成為探究細胞類群多樣性的常用技術手段，而不同的測序技術在細胞捕獲和基因捕獲效率上具有各自不同的優勢[3]。本研究結合了SMART-seq2和10x Genomics Chromium 3』兩種單細胞測序技術，並整合這兩種平臺的數據進行生物信息學分析，充分發揮不同數據類型的優勢，獲得高解析度的肝癌免疫圖譜。癌旁組織和外周血是腫瘤相關研究中常用的對照組織，而其他相關的免疫器官或病理組織則較少受到關注。例如，腹水是肝癌患者常見的病理現象，其產生與肝癌預後不良有關，然而腹水中的免疫細胞組成及其與肝癌的聯繫尚不清楚。因此，本研究收集肝癌病人的癌組織、癌旁組織、淋巴結、外周血和腹水五種組織的CD45+免疫細胞進行實驗，並分析肝癌免疫微環境中的細胞類型、表達特徵，以及不同組織之間細胞的動態變化與聯繫。

圖1 課題總體設計

【主要發現】

1. 不同組織的免疫組成有較大差異，腫瘤中的巨噬細胞構成腹水中髓系細胞的主要來源。

整合兩種單細胞測序數據，研究人員刻畫了高解析度的肝癌免疫圖譜，包括T細胞、B細胞、NK細胞和髓系細胞等主要細胞類群以及主要類群下屬的40類細胞亞群。這些細胞亞群在不同組織中呈現出不同的細胞類型富集特徵，其中腹水中的細胞類型呈現明顯的特異性。

為探究腹水中細胞的潛在起源，研究者將腹水中的免疫細胞與其他組織中的細胞進行基因表達比對，發現腹水中的淋巴細胞和髓系細胞來源明顯不同，淋巴細胞與外周血來源的細胞有明顯的相似性，而髓系細胞主要和腫瘤組織來源的細胞類似。隨後，通過前沿的生物信息學分析方法RNA velocity[4]和基於線粒體突變的進化樹構建[5]，研究者對巨噬細胞從腫瘤到腹水的遷移過程進行了確認。

2. 腫瘤中的巨噬細胞兩種不同的狀態(TAM-like和MDSC-like)

通過與其他數據中的巨噬細胞進行轉錄組比對，研究者發現肝癌腫瘤中的巨噬細胞呈現兩種不同的狀態：TAM-like和MDSC-like狀態。生存分析表明，前者的特徵基因，特別是SLC40A1和GPNMB與不良預後有關。通過CRISPR技術在THP-1誘導的巨噬細胞系中進行基因敲除和功能驗證實驗，研究者發現這兩個基因在細胞炎症反應中起重要作用。

3. 腫瘤中的LAMP3+DC是成熟態的DC，具有向肝淋巴結遷移以及與多種淋巴細胞相互作用的潛在能力

腫瘤微環境中的樹突狀細胞，傳統上分為cDC1和cDC2，在本研究中鑑定出一群新的DC，即LAMP3+DC。通過體外實驗和生物信息學分析，研究者發現其可能同時起源於cDC1和cDC2。而且這一類樹突狀細胞不僅存在於肝癌中，也存在於乳腺癌[6]和肺癌[7]中。

圖2 上圖：將肝癌組織中樹突狀細胞的RNA velocity的計算結果投射到在Diffusion Map坐標上，顏色代表不同的細胞群。下圖：基於線粒體基因突變構建的LAMP3+DC進化樹

腫瘤浸潤性的LAMP3+DC發揮了廣泛調節淋巴細胞的作用，它們與T細胞和NK細胞上表達的配體-受體相互作用數量最多。LAMP3+DC通過CCL19-CCR7和CCL22-CCR4吸引T細胞，並通過CD86-CD28作用於調節T細胞亞群，通過CD86-CTLA4作用於耗竭性T細胞亞群。研究者通過多色免疫組化對表達PD-1點T細胞與表達PD-L1的LAMP3+DC進行了空間位置的判斷，發現其出現出相鄰的位置，為其相互作用提供了另一角度的證據。

【討論】

文章的共同通訊作者任仙文副研究員特別指出，本項研究首次對肝癌臨床樣本進行包括病理組織在內的多組織位點的收集，並利用前沿的生物信息學分析方法，通過自體對照，不僅描述了肝癌微環境的免疫組分和狀態，而且描繪了腫瘤浸潤免疫細胞跨組織的動態過程。此項國際領先的開創性工作，可為人們研究肝癌和其他疾病中的免疫細胞，以及開發新的臨床檢測與治療方案提供新的思路。

北京大學生命科學學院博士生張啟明、北京大學前沿交叉學院博士生何堯和北京大學第九臨床醫學院（北京世紀壇醫院）博士生羅楠為該論文的並列第一作者，北京大學BIOPIC和生命科學學院任仙文副研究員、張澤民教授、首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院彭吉潤教授以及勃林格殷格翰公司資深主任科學家劉康博士為該論文的共同通訊作者。該課題得到了自然科學基金和北京未來基因診斷高精尖創新中心的資助，以及北大高通量測序平臺的協助與支持。

關於勃林格殷格翰與北京大學戰略合作

2017年5月，北京大學和勃林格殷格翰公司籤署協議，建立戰略夥伴關係合作，旨在共同推動早期科學創新，以填補腫瘤、腫瘤免疫與免疫調節、呼吸系統、心血管和代謝系統、中樞神經系統疾病以及新興領域的醫療需求。該戰略夥伴合作關係包含多種合作形式，包括以具體科研項目為基礎的共同研究、博士後獎學金及研究員獎、系列藥物研發講座等。

北京大學和勃林格殷格翰希望通過戰略合作，充分利用高校和企業資源，進行有針對性的創新，帶來更多具有突破性潛力的、同類第一（first-in-class）的新藥，提高雙方的核心競爭力，促進人類健康，實現共贏。

End

參考文獻

1. Forner A., Reig M. and Bruix J., Hepatocellular carcinoma, Lancet 391, 2018, 1301–1314.

2. Gnjatic S., Bronte V., Brunet L.R., Butler M.O., Disis M.L., Galon J., Hakansson L.G., Hanks B.A., Karanikas V., Khleif S.N., et al., Identifying baseline immune-related biomarkers to predict clinical outcome of immunotherapy, J. Immunother. Cancer 5, 2017, 44.

3. Ziegenhain C., Vieth B., Parekh S., Reinius B., Guillaumet-Adkins A., Smets M., Leonhardt H., Heyn H., Hellmann I. and Enard W., Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods, Mol. Cell 65, 2017, 631–643.e4.

4. La Manno G., Soldatov R., Zeisel A., Braun E., Hochgerner H., Petukhov V., Lidschreiber K., Kastriti M.E., L nnerberg P., Furlan A., et al., RNA velocity of single cells, Nature 560, 2018, 494–498.

5. Ludwig L.S., Lareau C.A., Ulirsch J.C., Christian E., Muus C., Li L.H., Pelka K., Ge W., Oren Y., Brack A., et al., Lineage Tracing in Humans Enabled by Mitochondrial Mutations and Single-Cell Genomics, Cell 176, 2019, 1325–1339.e22.