關於動物行為學實驗,這份功課拿走不謝!

動物行為學實驗是研究人類發病機制、評價動物模型造模效果和新藥效果的一種重要實驗手段，在生命科學、醫學、藥學、軍事醫學和心理學等領域中被廣泛應用。動物行為學實驗可以科學客觀地評價動物的溝通行為、社交行為、學習行為和探索行為等，它可以幫助科研人員探索認知、情緒和運動等複雜的生命現象。

動物行為學最初的研究對象是正常動物, 後來擴展為實驗動物，在許多生物醫學研究中，都會用到小鼠疾病模型，比如在神經科學、腦功能領域，有阿爾茲海默病AD小鼠模型、帕金森病PD小鼠模型、缺血缺氧性腦病HIE小鼠模型，抑鬱症小鼠模型……常通過這些疾病模型結合動物行為學實驗來研究發病機理、藥物效果等。
但當初學者開始查閱如何做某些行為學實驗，過程中會遇到許多不懂的問題，需要檢索不同網站的資料。比如想知道別人用這個實驗常衡量哪些數據指標，圖表形式，但查一些中文資料發現只有實驗方法，圖片多用三線表，所以需要結合一些SCI高分文章參考；在做行為學實驗數據導出時，常常導出許多數據，但哪些數據有用、如何處理數據形成圖表的過程在研究論文中都未一步步詳細地完全展示，這時候需要自己領悟、百度或者論壇求助。

今天小編就介紹幾個常用的行為學實驗方法（曠場實驗、轉棒實驗、新物體識別實驗）以及應用GraphPad Prism8軟體處理實驗數據的詳細步驟。

曠場實驗(open field test，OFT)通過反映小鼠在陌生的曠場中的自發活動行為與探索行為，衡量小鼠的焦慮情況，小鼠在中心運動路程越少，說明小鼠越焦慮。

本實驗利用小鼠的趨避性，即小鼠畏懼開闊、陌生的環境，故趨向於貼牆活動，即在曠場的外周區域活動，而小鼠也有探索新環境的天性，會在中央區域探索，但兩者之間發生探究與迴避的衝突行為，產生焦慮心理。

實驗開始時，將小鼠放在曠場實驗裝置的正中間，使小鼠在實驗裝置內自由運動5分鐘，記錄小鼠在各區域內運動的路程和時間。

每隻小鼠實驗後，清理小鼠糞便、尿液，用水衝洗後擦乾，以防止前一隻小鼠留下的氣味對後一隻小鼠的行為學表現有影響。實驗員最好是同一個人、同一件實驗服、同一樣力度抓放小鼠。

各組小鼠在曠場中的外周運動路程、中心運動路程和總路程。小鼠在中心運動路程越多，說明小鼠焦慮水平越低，藥物抗焦慮效果更好。

2019年發表在Nature Communications(11.878)的一篇文章Activating newborn neurons suppresses depression and anxiety-like behaviors，表明氟西汀治療的兩組小鼠（-hM4Di（+Vehicle）和+hM4Di（+CNO））比生理鹽水作對照的小鼠的中心運動路程更多，且總運動距離無顯著差異，這表明氟西汀具有抗焦慮作用。

用於小鼠體力研究、神經系統藥物研究、藥物毒性研究等。根據小鼠善攀爬的生理特性設計的，小鼠會在自動轉動的輪子上攀爬，用於檢測動物體力。設置好轉速並接通電源後輪子可自動轉動，該轉動棒在5分鐘的時間內逐漸將旋轉速度從2 rpm增加到50 rpm。小鼠先適應訓練一次，然後進行三個連續試驗，每次實驗為5分鐘。每個試驗之間的休息時間為30分鐘。最後三次試驗中小鼠從轉棒上掉下來的平均等待時間用於分析。

小鼠掉落後易跑動，最好在一個安全的環境下操作，防止小鼠逃逸。從轉棒上掉落的潛伏期，即小鼠從轉棒上掉下來的平均等待時間，即從開始計時到第一次掉落所用的時長

轉棒實驗在不同的文獻中實驗步驟有所不同，可以根據自己的需要選擇合適的實驗步驟。有的實驗測試3天潛伏期，有的只測試1天；轉速設置也有所不同，有的旋轉速度在5分鐘內逐漸增加從2 rpm增加到50 rpm，有的在前2分鐘內逐漸增加至50 rpm，而後3min以50 rpm恆定轉速。

比如上圖中2015年、2016年發表在Brain(11.814)的兩篇文章，實驗對象均為C57小鼠，但實驗方法為上圖綠色箭頭所示模式圖，可見是測試的天數和轉速都不同，類似不同實驗方法來進行轉棒實驗的文獻還有很多(https://v.xiumi.us/board/v5/4811g/208166387這個連結裡是我查到的7篇英文高分文章中的轉棒實驗圖及方法，懶得自己查的小夥伴可以自行查看）。這提示我們，在具體實驗時，可以參考一篇或多篇實驗方法來進行預實驗優化。

新物體識別實驗(Novel Object Recognition,NOR)常用於評估小鼠學習記憶能力。

根據小鼠天生對新事物的好奇心設計的，依靠小鼠對新事物的探索情況來評估小鼠學習記憶能力。首先，讓小鼠自由探索兩個相同的物體，間隔一段時間後，讓小鼠探索兩個物體，一個為新物體，另一個為舊物體，如果對新物體的探索時間更多，說明小鼠記住了舊物體，學習能力較佳。

圖片來源：附參考文獻【3】

Day1，預適應期，小鼠在實驗裝置內(無物體)自由運動5分鐘。Day2-3，適應期，小鼠在實驗裝置內(無物體)自由運動20分鐘。Day4，學習訓練期，小鼠自由探索兩個相同的物體（兩個物體對角線放置）10分鐘，間隔1小時後，進行測試，更換新物體，讓小鼠探索兩個物體（兩個物體對角線放置），即一個為新物體，另一個為舊物體，記錄小鼠在各區域內運動的路程和時間。同曠場實驗注意事項類似，及時清理小鼠糞便、尿液，氣味等。小鼠對新舊物體的探索時間和距離，即小鼠在新舊物體周圍活動的時間和距離。區分係數（Object recognition index）=探索新物體的時間/總探索時間*100%

圖片來源：附參考文獻【4】

2019年發表在Cell(36.216)的一篇文章Multi-sensory Gamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and Improves Cognition，作者通過使用特定頻率的光和聲音治療阿爾茨海默病模式小鼠，並通過新物體識別實驗檢測小鼠的認知恢復情況。在總運動距離即小鼠的運動能力不變的情況下，與對照組（沒有聲音刺激或隨機頻率聲波刺激）相比，經過40Hz的聲音治療後，小鼠的區分係數更高，說明小鼠的認知能力提高。

把 「實驗組名、總路程、中央的路程、邊上的路程」 粘貼至一處，方便編輯。下一步，把距離單位由mm換算成cm，即每個單元格數值/10即可，本文以總運動路程的數據為例，其他行為學實驗數據導出過程均類似。

打開GraphPad Prism 8，如圖新建一個column圖，並把上圖數據直接粘貼至圖片所示處。

點擊下圖中箭頭所示後，彈出頁面，選擇圖片中紅色框標記處，individual values選擇第二個，Plot選擇Mean with SEM ,最後點擊OK

選擇圖片中紅色框標記處，可以修改對應的標題、坐標數值、長短、樣品點形狀、顏色等。此處參考上文介紹的那篇曠場實驗文獻中的圖片模式，也可參考其他SCI文章中的圖表，根據自己的需要修改即可。

篇幅有限，今天小編主要介紹了曠場實驗、轉棒實驗、新物體識別實驗的實驗方法、原理、注意事項以及它們在高分文獻中的應用。最後介紹了如何應用GraphPad Prism8軟體處理實驗數據、繪製圖片的步驟。希望對大家有所幫助。

參考文獻

[1] Tunc-Ozcan E, Peng CY, Zhu Y, Dunlop SR, Contractor A, Kessler JA. Activating newborn neurons suppresses depression and anxiety-like behaviors. Nat Commun. 2019;10(1):3768. Published 2019 Aug 21.

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[4] Mehdipour M, Etienne J, Chen CC, et al. Rejuvenation of brain, liver and muscle by simultaneous pharmacological modulation of two signaling determinants, that change in opposite directions with age. Aging 2019;11(15):5628-45.

[5] Martorell AJ, Paulson AL, Suk HJ, et al. Multi-sensory Gamma Stimulation Ameliorates Alzheimer's-Associated Pathology and Improves Cognition. Cell. 2019;177(2):256–271.e22.

[6] 孫秀萍,王瓊,石哲,陳善廣,劉新民.動物行為實驗方法學研究的回顧與展望[J].中國比較醫學雜誌,2018,28(03):1-7.

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