撰文 | 十一月
責編 | 兮
類器官可以由誘導多能幹細胞、胚胎幹細胞或者成體幹細胞產生【1】。成體幹細胞來源的類器官具有自組裝的3D結構，也能夠代表性地表現出不同器官的細胞組成以及不同組織的功能。對於一些基因敲入小鼠品系來源的類器官，由於通過基因敲入對目標基因加上了不同的「標籤」，使得此類類器官能夠成為回答多種生物過程中未解之謎的重要的、可視化的工具【2-4】。然而，精確整合外源性DNA序列到人源類器官仍然缺乏穩健的敲入方法。
2020年3月2日，荷蘭Hubrecht Institute的Hans Clevers研究組在Nature Cell Biology雜誌上發表文章Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依賴的CRISR-Cas9技術快速高效地對人源類器官進行基因敲入，作者們將該技術命名為CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，為人源類器官的內源基因敲入提供了重要的工具平臺。
依賴於同源修復（Homology directed repair, HDR）進行基因敲入利用的是細胞進行DNA雙鏈斷裂修復的分子機制。通過CRISPR-Cas9技術可以在特定位置引入雙鏈斷裂位點。HDR對於靶向插入來說是最常用的方式之一，但是此過程的效率不高而且要求細胞要處於S期【5】，這大大限制了科學家們利用此技術進行基因敲入。另外，有研究表明CRISPR激活的DNA雙鏈斷裂會引起TP53的損傷響應以及誘導暫時的細胞周期滯留現象【6】。實驗發現，如果使TP53失活，會增加細胞中HDR介導的基因敲入的效率。因此，為了提高基因敲入的效率，有的實驗方法會建議通過抑制TP53的活性解決效率低下的問題【7】。
非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)也是DNA修復系統之一，但與HDR不同的是，NHEJ在所有的細胞周期中均活躍進行，並且不需要克隆同源臂。由於NHEJ被認為是容易出錯的DNA修復系統，因此在此之前科學家們對於其在精確的轉基因插入中作用沒有引起重視。為了避免細胞周期限制、提高基因編輯的效率，作者們將目光放在了NHEJ介導的基因敲入技術，利用NHEJ介導的基因敲入對不同人成體幹細胞類器官進行了基因敲入，為在內源水平對靶標基因的可視化研究提供了利器。
圖1 HDR與NHEJ介導的基因敲入的技術路線以及優劣比較
為了檢測利用NHEJ介導的CRISRP-Cas9技術在人類器官中進行基因敲入的方法是否可行以及與HDR介導的方式之間的對比（圖1），作者們首先建立了兩種難以進行轉染的人類器官：肝臟導管類器官及肝細胞類器官，並對此兩種不同介導方式的基因敲入技術產生的類器官進行靶標基因測序確認。作者們發現，從基因敲入效率來看，NHEJ在兩種類器官中的靶標基因敲入效率都要高於HDR介導的基因敲入方式。而且，即使是在抑制TP53的活性之後，雖然HDR介導的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介導的基因編輯效率要低，並且NHEJ介導的基因編輯技術不依賴於對TP53活性的抑制，進一步簡化了基因敲入的流程也減少了其他遺傳操作可能帶來的副作用。
除此之外，作者們還利用NHEJ介導的CRISPR–HOT技術對目標基因加上螢光標籤，建立了人肝臟導管類器官的報告基因品系，可以利用活體成像、切片染色等方式可視化觀察內源表達的基因表達模式以及動態變化過程。另外，利用CRISPR–HOT技術也可以對多種罕見的腸道細胞來源的類器官進行靶標基因標記，用以研究這些基因在體內的功能和調節狀況。
一直以來，在肝臟細胞中有絲分裂紡錘體的定位和正確極性的建立以及紡錘體組織結構之間的調節是備受爭議的問題。作者們利用基因敲入的肝細胞類器官從三維的角度對肝細胞的分裂以及紡錘體建立之間的關係進行了研究。通過建立紡錘體以及組成型基因敲入的雙報告基因系統，作者們對肝細胞類器官的動態細胞分裂過程進行了監測。作者們發現，在體外肝細胞分裂過程中，不是靜止的而是有很大的變化，紡錘體的位置在細胞周期前中期和胞質分裂這兩個時期的位置相似，而在這兩個時期中間紡錘體軸向隨著時間的推移發生顯著旋轉。
另外，作者們還發現大多數的細胞（95%）二倍體肝細胞分裂，少數單核細胞（2–3%）分裂後變成一個雙核細胞，另外還有極少數情況會形成一個三極性的紡錘體結構，最終形成一個單核細胞和一個雙核細胞（圖2）。TP53在維持基因組的穩定性中發揮著關鍵的作用，在肝細胞中敲除TP53會造成多倍體以及非整倍體的出現。作者們發現，在敲除TP53後，肝細胞類器官中肝細胞的紡錘體會出現異常。這進一步說明了CRISPR–HOT技術的應用可以避免HDR介導的基因編輯技術對於TP53活性抑制的依賴，減少了不必要的遺傳背景的介入。
圖2 雙報告基因肝細胞類器官中肝細胞分裂的不同方式
總的來說，Hans Clevers研究組的工作建立了不依賴於同源臂的基因編輯技術，以NHEJ為藍本建立了新穎的、穩健的基因敲入技術CRISPR–HOT，破除了之前技術對於特定細胞周期的依賴提高了基因編輯的效率，而且也去除了基因編輯方式對於TP53活性抑制的依賴，對於肝細胞等成體幹細胞來源的類器官可視化研究提供了可靠的基因編輯方式。
值得一提的是，2月20日，Hans Clevers研究組在Cell Stem Cell進行發文，題為CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank，利用CRISPR依賴的單鹼基編輯技術，對荷蘭的囊性纖維化疾病（Cystic Fibrosis）病人樣品建立起的類器官生物庫中的樣品的致病基因CFTR（CF transmembrane conductance regulator gene）基因中的突變進行編輯和修復，為臨床上囊性纖維化疾病尤其是相對罕見的突變的修復提供了相匹配的治療方案，同時也為體外進行大規模藥物篩選並對病人進行個性化醫療方案的設計提供了重要的資料庫（圖3）。
圖3 囊性纖維化病人類器官生物庫的建立、藥物篩選以及基因編輯修復