來源：丁香園論壇 2007-07-11 21:00
MTT實驗是檢測細胞活力的實驗方法，由於細胞活力與細胞數呈正相關，因此也常常用來檢測細胞的增殖情況。
MTT的原理：活細胞有琥珀酸脫氫酶，將MTT還原成棕褐色沉澱。由於一般介紹園子裡已經很多，筆者將自己的心得按照實驗流程與大家交流交流。
1、培養好細胞點板。
養細胞沒啥好說的，如果不知道細胞如何養，那就看看相關的文獻方法。如果知道了細胞的名字，就可以上www.atcc.org檢索細胞的培養信息，這個網站上的培養方法是標準培養方法。當然可以根據自己實驗要求進行修改。由於細胞計數很繁瑣，點板時的細胞濃度是最難掌握的，這一點筆者的心得如下：
自己先將細胞養一段時間，大概了解細胞的增殖情況，在MTT檢測時實際上要求細胞大概能長滿96-孔板的80-90%，如果打算養48小時就檢測，根據細胞的生長情況反推點板時的細胞濃度狀況。這時可以將細胞不進行計數，將消化好的細胞混勻後（可能是10 ml）直接在一個廢棄（最好進行過無菌處理）的96孔板中依次加入180、100、50微升細胞，將細胞放置幾分鐘就會沉到板底了，這時在顯微鏡下觀察，推測哪個孔的細胞48 h能基本長滿板底，假設50 微升的孔比較合適，而點板時沒孔需點200 微升，那麼就將細胞濃度再稀釋4倍就可以正式點板了，這時順便將細胞進行計數（因為實驗記錄要求寫啊）。這樣就OK了！如果細胞還太多，將細胞稀釋4倍後再重複以上操作。注意：不要過分信賴細胞計數，因為細胞計數的取樣量為20 微升左右，由於顆粒的分布不均勻，代表性是很差的。建議：細胞計數一定要會，但不要完全依賴它。
點板時一定要將細胞消化成單個細胞，而且一定要混勻，最好用排槍，否則，MTT的SD會狂大！
2、點板布局。
其實這一點很多人不懈一顧。如果你的細胞要養48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個孔的水分。因為細胞培養過程中，邊孔的水分蒸發很快，培養液及裡面的藥物會出現濃縮現象，細胞的狀況就複雜了，有些人稱之為「邊緣效應」這些孔的SD也會狂大，既然如此，不如不用。
3、加MTT。
如果確認你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強，比如穀胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉澱，這種效果可能是你不需要的。
4、加入MTT後的反應
時間為3-4h，此時棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉澱溶解完全，儘可能將水棄除乾淨，加入DMSO後在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細胞貼壁不好，此時的沉澱在棄去液體時易丟失，因此貼壁不好的細胞在點板時記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要麼在棄液體時先用甩板機離心，再輕輕棄去液體。關於DMSO的量，每孔的體積有點兒差異不幹擾檢測，只要能將沉澱完全溶解就行了。至於DMSO的體積差異不同為什麼不影響檢測值已經被數學證明了，在此我不多說，如果有人不明白我再證明給他看。當然為了養成良好的實驗習慣，DMSO的體積還是一致的好。
5、檢測MTT。
還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標儀有單波長，你可以在檢測前掃描一下吸收譜，選用最大細說波長檢測就是了，最大波長，大概在550nm附近，必要時加一個參比波長以扣除非特異性吸收。
6、吸收值分析。
在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差佔的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性範圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
7、如果你覺得MTT中出現的問題不好解決，那麼建議你做CCK-8實驗，原理與MTT相似，但操作上簡化些，當然，費用也稍微高一些。
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