MTT法

2021-01-20 實驗之家


MTT是一種粉末狀化學試劑,全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,漢語化學名為 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名:噻唑藍 。是一種黃顏色的染料。



MTT法檢測原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢(Formazan),而死細胞無此功能。用DMSO溶解甲臢後在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數範圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

用途

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定2.細胞增殖及細胞活性測定。


注意

MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力,但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候,為了保證實驗結果的線性,MTT 吸光度最好在0-0.7 範圍內。

MTT一般最好現用現配,過濾後4℃避光保存兩周內有效,或配製成5mg/ml保存在-20℃長期保存,避免反覆凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管裡,用的時候現配,直接往培養板中加,沒必要一下子配那麼多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。

MTT有致癌性,用的時候小心,有條件最好帶那種透明的薄膜手套.配成的MTT需要無菌,MTT對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關係,畢竟時間較短,或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.

配製MTT時用PBS溶解,也有人用生理鹽水配,60℃水浴助溶。




比較

      Cell Counting Kit-8(CCK-8)法原理:CCK-8中的主要成分WST®-8能被細胞內的脫氫酶還原為水溶性的橙黃色甲臢,生成甲臢的量與細胞數成正比,可間接測定活細胞數量。

Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒,是一種基於WST-8的廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

Ø WST-8是一種類似於MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快,則顏色越深;細胞毒性越大,則顏色越淺。對於同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關係。 

Ø WST-8是MTT的一種升級替代產品,和MTT或其它MTT類似產品如XTT、MTS等相比有明顯的優點。首先,MTT被線粒體內的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液來溶解;而WST-8和XTT、MTS產生的formazan都是水溶性的,可以 省去後續的溶解步驟。其次,WST-8產生的formazan比XTT和MTS產生的formazan更易溶解。再次,WST-8比XTT和MTS更穩定, 使實驗結果更加穩定。另外,WST-8和MTT、XTT等相比,線性範圍更寬,靈敏度更高。 
該方法已被廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

CCK-8的原理跟MTT其實是相同的,不同之處在於CCK-8法生成的formazan是水溶性的,不需要再吸出培養液加入有機溶劑溶解這個步驟,因此可以減少一定的誤差。其他優點就是重複性優於MTT;對細胞毒性小;為1瓶溶液,毋需預製,即開即用。
但是CCK-8比MTT的價格要貴不少,所以一般來說,還是MTT法用的多。


      乳酸脫氫酶(LDH)法檢測原理:乳酸脫氫酶(LDH)是存在於細胞質的一種酶,當細胞膜受到損傷時,LDH 會釋放到培養基中。由於釋放出的LDH 穩定,檢測培養基中LDH 的量可以作為測定死細胞和受損細胞數量的指標。Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®可以測定受損細胞所釋放出的LDH,其原理是LDH 催化乳酸生成丙酮酸和NADH,NADH 通過電子載體可將水溶性四唑鹽WST®(無色)還原成甲臢產物(橙色),WST®甲臢產物的吸光度與LDH 的量呈正比,利用此原理可以測定死細胞和受損細胞的數量。

    MTT法和CCK-8法反映的是細胞的存活率,雖然也可以間接反映細胞毒性,但當外在因素改變(線粒體)脫氫酶活性時,有時結果就會出現偏差。這時最好的方法是同時測定LDH的釋放來驗證細胞的損傷率,用2種方法來相互驗證會使結果更可靠。



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