撰文 | 鹹姐
責編 | 兮
腫瘤的發生是一個多步驟的過程，在最初的癌細胞轉化遇到瓶頸之後，它的最終生存依賴於它在有利的環境中定居的能力，而這種能力取決於一個極其複雜的體系，即「腫瘤生態系統」，它是腫瘤細胞在其微環境中與其他腫瘤細胞和宿主細胞的相互作用，並通過進化適應不斷變化的環境的一個多樣性群落。腫瘤周圍的生態系統不僅促進了癌細胞的生長，也為它們提供了一個安全的「住所」，以克服免疫系統的攻擊。在腫瘤發生過程中，具有基因異質性的不同的癌細胞的逐漸出現、進化，並與腫瘤微環境中的細胞相互作用，從而導致宿主代謝被劫持、免疫逃避、轉移，以及最終死亡【1,2】。
腫瘤由多種細胞組成，不同區域的腫瘤細胞可以代表腫瘤生態系統的異質性，構成不同的腫瘤、間質和免疫細胞類型。在免疫系統和轉化細胞之間存在著一種持續的競爭關係，是腫瘤細胞死亡或存活的重要原因。一種有利的腫瘤生態系統將有助於惡性細胞在營養缺乏和免疫力選擇壓力下存活。
此外，腫瘤生態系統細胞如腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、內皮細胞（EC）和免疫細胞的異質性可進一步影響臨床治療反應。腫瘤異質性是許多癌症存在並存活的關鍵，對腫瘤的進展和治療效果有著很大的影響【3,4】。而肝癌（HCC），作為全球癌症相關死亡的第二大原因，其高復發率與腫瘤異質性有著密切的關係。然而，在HCC生態系統中，定義瘤內異質性（ITH）的轉錄、空間和功能背景以及由此產生的獨特的細胞間相互作用的系統研究仍難以實現。
與此同時，研究證實，腫瘤細胞表現出的表型可塑性有助於細胞多樣性和腫瘤的進化。而胚胎發育和腫瘤發生之間存在相似性，表明腫瘤細胞可以重編程，或轉分化為腫瘤幹細胞樣細胞（CSC）【5】。此外，一些惡性細胞可以表達胚胎發育特異性抗原，如HCC中表達的甲胎蛋白（AFP）【6】。這些研究將惡性腫瘤細胞的表型特徵與早期胚胎發育程序聯繫起來，腫瘤細胞可以重現胚胎早期發育的特徵。但是，腫瘤生態系統重現早期發育特徵的能力到底如何也依舊未知。
基於以上問題，2020年9月24日，來自新加坡基因組研究院的Ramanuj DasGupta團隊在Cell上在線發表題為「Onco-fetal Reprogramming of Endothelial Cells Drives Immunosuppressive Macrophages in Hepatocellular Carcinoma」的文章，繪製了一張人類肝臟從發育到疾病的單細胞圖譜，揭示了一個可以同時驅動胎肝發育和HCC的免疫抑制的腫瘤-胚胎重編程生態系統，為HCC的治療幹預提供了新靶點。
為了解肝癌中腫瘤生態系統的複雜性以及惡性細胞、間質細胞和免疫細胞之間的動態相互作用，本文研究人員採用了基於微滴的單細胞轉錄組測序方法（圖1）。首先，研究人員分析了來自14例HCC病人和1例正常人肝臟的57個區域的大約74000個細胞，鑑定出29個不同的主要聚類，分別代表上皮細胞、免疫細胞、內皮細胞和成纖維細胞。有趣的是，研究人員在HCC中觀察到的腫瘤和癌旁組織的某些細胞類型的正常-特異性聚類，提示著腫瘤微環境（TME）可能發生了重塑。
除了觀察到的正常和腫瘤生態系統之間的顯著差異，研究人員也深入識別了疾病特異性細胞類型。這其中存在著患者特異性的腫瘤細胞聚類，由此強調了患者特異性的突變對上皮細胞轉錄組的主要影響，除此之外，在不止一個病人的結果中出現了一些亞群，表明腫瘤上皮細胞也具有共同的分子特徵。
圖1 單細胞測序示意圖
從這個單細胞肝臟圖譜獲得的主要聚類中，在腫瘤和癌旁組織之間存在顯著差異的兩類細胞型是EC和巨噬細胞。因此，研究人員通過子聚類重新分析了EC和髓系亞群。EC可以分成11個聚類，其中10類是在正常或是在腫瘤組織中特異性表達的，尤其是PLPP3+、IGFBP3+和PLVAP+ EC在腫瘤組織中富集。其中，質膜囊泡相關蛋白（PLVAP）在肝臟發育和疾病中起著重要作用，RNA速率（RNA velocity）分析預測腫瘤特異性PLVAP+ EC可能來自中間的EC亞群。
與此同時，單核吞噬細胞（MNP）的子聚類分析發現肝臟中含有兩個單核細胞聚類、三個樹突狀細胞聚類以及四個巨噬細胞聚類，其中前兩類在正常組織中富集，而巨噬細胞主要存在於腫瘤中。
差異基因表達分析確定了TAM亞群的獨特標記——表達TAM1的葉酸受體β（FOLR2）、骨橋蛋白（SPP1）陽性的TAM2和富含金屬硫蛋白1G（MT1G）的TAM3。RNA速率分析發現HCC中的兩類FOLR2+ TAM1來源不同，一類來源於單核細胞，而另一類似乎是胚胎來源的駐留於組織中的巨噬細胞（TRM）。
有趣的是，單核細胞來源的FOLR2+聚類顯示了更高的HES1表達，意味著Notch信號可能在TAM1亞群的出現中發揮作用。由此表明在HCC中，單核細胞來源的巨噬細胞可能被重編程以獲得與胚胎類似的表型。而流式細胞術和RNA螢光原位雜交技術均證實了單細胞測序圖譜的結果，建立了內皮和巨噬細胞群的特異性標記物，提示在HCC中存在著胚胎相關的PLVAP+ EC和胚胎樣FOLR2+ TAM1。
隨後，研究人員對16周和21周估計胎齡（EGA）的人胎肝組織進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq），並將其與HCC-scRNA-seq數據進行了聚合。單細胞圖譜顯示胚胎肝細胞和腫瘤內皮細胞以及髓細胞之間顯著的相似性。
最重要的是，研究人員發現PLVAP+ EC主要富集於胚胎和腫瘤組織中，而在正常內穩態細胞中缺失，由此進一步證實了在HCC中PLVAP+ EC發生類似胚胎發育的重編程的可能性。而對MNP的分析也揭示了類似的驚人發現，在HCC中出現胚胎肝臟相關的FOLR2+巨噬細胞的特異性富集。
而對小鼠肝細胞、人類胚胎肝臟以及腫瘤巨噬細胞的跨物種比較分析更清晰地表明HCC中FOLR2+ TAM1與胚胎來源的巨噬細胞具有顯著相似性，表明HCC中TAM的胚胎樣重編程。
進一步地，研究人員通過NicheNet分析（可以通過連接配體和靶基因表達來預測細胞間的相互作用）表明VEGF信號對胚胎肝臟和HCC中PLVAP+ EC出現的重要性以及其可能促進TME腫瘤-胚胎重編程。
而為了揭示正常和腫瘤生態系統中受體-配體相互作用，研究人員進行了細胞-細胞相互作用分析（CellPhoneDB），表明TAM1可以促進HCC的免疫抑制微環境的形成。
值得注意的，TAM1（CD163+）、Treg（TIGIT+）細胞以及PLVAP+ EC共定位於相同的位置，接近於ALB+腫瘤上皮細胞群，並且在PLVAP高密度區域出現CD163+和TIGIT+細胞的富集，提示TAM1主要定位於腫瘤免疫優勢部位的血管周圍。
與此一致的是，研究人員同時觀察到TIGIT+細胞在FOLR2+ TAM1的富集。由此進一步證明了腫瘤生態系統中FOLR2+ TAM1、Treg和腫瘤-胚胎EC之間的關係。
此外，針對小鼠胚胎移植肝臟、人類胚胎肝臟和TAM1巨噬細胞的保守的單細胞基因調控網絡（GRN）分析表明，不同的FOLR2+ TAM1集群可能代表著細胞狀態（單核細胞來源的重編程和TRM），而不是細胞類型，因此提示HCC中TAM的腫瘤-胚胎重編程。而PLVAP+ EC可以促進TAM1中Notch信號的激活，從而促進微環境介導的腫瘤-胚胎重編程。
綜上所述，本文描繪了一個全面的單細胞人類肝臟圖譜，以了解從胚胎發育到肝癌的整體細胞背景。發現在胎肝和TEM之間的共同的細胞類型、轉錄程序、GRN和信號通路，首次揭示了胚胎肝臟發育和HCC生態系統之間的共享程序——腫瘤-胚胎重編程，同時表明VEGF/NOTCH信號通路在維持HCC免疫抑制的腫瘤-胚胎生態系統中的重要作用。本文的發現不僅為HCC的治療幹預提供了新的靶點，也可以作為HCC免疫治療的潛在生物標誌物，同時也為識別和理解其他癌症中類似的機制開闢了道路。
製版人：琪醬
參考文獻
1. Xianwen Ren, Boxi Kang, Zemin Zhang. Understanding tumor ecosystems by single-cell sequencing: promises and limitations.Genome Biol. 2018; 19: 211.
2. Eric A. Smith, H. Courtney Hodges. The spatial and genomic hierarchy of tumor ecosystems revealed by single-cell technologies.Trends Cancer. 2019; 5(7): 411–425.
3. Tabassum, D.P., and Polyak, K. Tumorigenesis: it takes a village.Nat. Rev. Cancer. 2015; 15, 473–483.
4. McGranahan, N., and Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.Cell. 2017; 168, 613–628.
5. Hans Clevers. The cancer stem cell: premises, promises and challenges.Nat Med. 2011; 17(3):313-9.
6. Behne, T., and Copur, M.S. Biomarkers for hepatocellular carcinoma.Int. J. Hepatol.2012, 859076.