蒙娜麗莎的微笑一直是世人探究的一個神秘的謎團，它來源於義大利著名畫家達·文西創作的《蒙娜麗莎》肖像畫。它也是世界上最負盛名的肖像畫傑作。在此畫中，蒙娜麗莎那嫵媚笑容具有一種如夢似幻的千古奇韻，因此被美術史家稱為「神秘的微笑」。
《蒙娜麗莎》是義大利文藝復興時期著名畫家達·文西的一幅名畫，那神秘微笑的效果主要是通過畫中人的面部表情，尤其是嘴角浮現出來的嫵媚，顯示出了一種不朽的藝術魅力。500年以來，人們一直對」蒙娜麗莎」的神秘微笑莫衷一是。從不同的觀者或在不同的時間去看，每一個人的感受似乎都會有所不同。有時覺得她笑得十分的舒暢溫柔，有時又顯得相當的嚴肅，有時像是略含哀傷，有時甚至也會顯出一絲譏嘲和揶揄。在一幅畫當中，光線的變化不能像在雕塑當中產生那樣大的差別。但是在蒙娜麗莎的臉上，微暗的陰影也會時隱時現，而且還為她的雙眼與唇部披上了一層神秘的面紗。然而人的笑容主要表現在眼角和嘴角之上，達文西卻偏把這些部位畫得若隱若現的，由於有十分明確的界線，因此才會有這令人捉摸不定的「神秘的微笑」。
大家都知道，達·文西筆下的蒙娜麗莎是真有其人的。她是佛羅倫斯一位富有的女市民。達·文西為她作此畫像時，她年僅24歲。據說，在此前不久，蒙娜麗莎因為剛剛失去心愛的女兒而一直處於哀痛之中，悶悶不樂。達·文西在作畫時特意請來了音樂家和喜劇演員，想盡一切辦法讓蒙娜麗莎高興起來。而達·文西正是抓住了蒙娜麗莎那一剎那的微笑，瞬間成永恆，最終創作出了這幅不朽的畫作。
荷蘭的阿姆斯特丹當中的一所大學應用「情感識別軟體」則分析出蒙娜麗莎的微笑之謎當中所包含的內容及比例：高興佔 83％，厭惡佔 9％，恐懼佔 6％，憤怒則佔 2％。哈佛大學的神經科專家瑪格麗特利文斯通博士說，蒙娜麗莎的微笑則會時隱時現，但是它也與人體的視覺系統直接有關，而不是因為畫中人的表情有多麼的神秘莫測。
達·文西筆下的蒙娜麗莎的微笑是神秘莫測的，而且有關畫中主人公的身份、年齡及該畫真品究竟藏在何處，也莫衷一是，眾說紛紜，這就使得蒙娜麗莎的微笑越發顯得撲朔迷離了。就算現在已經到了21世紀，還是無人能正在詮釋這畫中的深意。儘管後人不知做過多少品評和揣測，留下越來越多的迷局，也留下了越來越多的說法。相信正在的答案，只能交給未來的人們去破解。