幹細胞行業的葵花寶典:MSC的培養方法總匯

2020-12-03 尚空間

人生小哲理

幹細胞者說

科普相當重要

尤其是前沿熱點

比如幹細胞

正文

路在腳下延伸,每前進一步都距離真理更近一步。

撰文:東海先生

來源:間充質幹細胞

分離MSC,是研究和應用MSC的第一步。

培養MSC,是研究和應用MSC的第二步。

大規模體外培養擴增高質量的MSC,是幹細胞企業所追求的。那麼建立合適的培養體系就顯得非常重要,而培養基是重中之重。相信有些幹細胞企業都有屬於自己的培養基專利,但是擁有專利不等於這個專利能培養出高質量的MSC。培養基配方稍加改動,就可以產生新的專利,而且專利的本質不在於追求培養出高品質的MSC。中草藥眾多、成份複雜多樣化,所以在MSC培養基中添加不同的中藥材成份,既可產生很多很多專利(拿走不謝)。

不同的實驗或者企業,MSC的培養體系很可能不同。

比如有實驗室培養MSC到第9代已經出現80%的衰老(SA-gal染色陽性)[1],而有的實驗室培養到第11代也只是40%的MSC出現衰老[2]。有的實驗室骨髓MSC只能擴增到第10代,臍帶、臍帶血、羊膜來源的MSC也只能擴增到12-14代[3]。但也有實驗室能做到臍帶MSC的培養能有效擴增到40代,依然具有多向分化潛能[4]。可見不同實驗室的培養體系對MSC的擴增效能有明顯的差異。

MSC的細胞質量伴隨著衰老快速下降(見圖)

MSC的體外擴增培養,不可避免地出現複製衰老(replicative senescence)[1, 2, 5,6],過度擴增還可能伴隨著基因組的不穩定性[7-9],影響到MSC的幹細胞功能[10]。相對於老鼠的MSC,人MSC的基因組穩定性比較好,而且不具有成瘤性[11-13]。

那麼MSC細胞衰老的最直觀表現有哪些?增殖速度減慢和胞體變大扁寬是所有細胞衰老的特徵[14]。

細胞核型分析顯示,骨髓MSC在培養至18代的時候出現了染色體異常和端粒酶縮短[11],而臍帶MSC在培養至30代才會出現染色體異常[13]。但是一般都會應用10代前的MSC,所以不用擔心染色體異常的問題。

所以,MSC細胞培養體系很重要!培養基、氧分壓和培養載體是三個關鍵因素。

1. 培養基

基礎培養有DMEM、DF-12、αMEM、IMDM等。不同基礎培養對MSC大規模擴增有沒有影響?目前這方面的研究極少。2018年的一篇文章證明以DMEM為基礎的擴增培養基能更好地促進人骨髓MSC在早期傳代(P4)中的增殖,但是在P5代後,DMEM就略遜色於αMEM(見下圖)[15]。不過,這個培養體系下,只是到P8代,MSC的倍增時間就達到8天,那就說明這個培養體系沒法支撐MSC的長期培養,還有優化的空間。

更多的研究關注於補充液對MSC體外培養的影響。

胎牛血清(FBS)是研究實驗室中最常見的培養補充液。有專家認為胎牛血清有幾個劣勢:成本高、批次變異(產生於其1800種蛋白質和4000種代謝物的不同濃度)、可用性有限(只有三分之一的胎牛血清產品符合細胞治療的監管要求)、各種豬的病毒汙染和以及引起異種免疫反應的可能性等等問題[16-18]。因此,2019年的一篇綜述認為FBS的使用可能被認為不足以培養臨床應用的MSCs[19]。其實,通過多次洗滌的方法,可以將胎牛血清蛋白降到非常低的水平而不足於引發免疫反應。

歐盟2013年有文件《Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products》規定胎牛血清供應方需要提供安全性檢測,關鍵是不能汙染了各種病毒(bluetongue and related orbiviruses、bovine adenovirus、bovine parvovirus、bovine respiratory syncytial virus、bovine viral diarrhoea virus、rabies virus、reovirus 3、bovine viraldiarrhoea virus、bovine polyoma virus等)。

和歐盟的態度一樣,美國FDA並不反對胎牛血清的應用。但FDA對胎牛血清的描述就沒有歐盟那麼具體,只需要保證胎牛血清不能來自疫區,明確提及不能汙染口蹄疫病毒和狂牛症病毒。

比如對病毒疫苗的生產就需要用到胎牛血清,FDA官網是這樣描述的:「Viral vaccines are produced in living cells, which, similarly, require the addition ofcomplex growth media components, such as fetal calf serum.」fetal calf serum指的就是胎牛血清。

澳大利亞治療品管理局允許使用FBS生產臨床級材料,只要它來自澳大利亞或紐西蘭等沒有狂牛症疫情的國家的牛。

臨床對照實驗顯示MSC臨床應用的安全性,MSC治療不會增加感染的風險,MSC治療組和對照組在惡液質和成瘤方面沒有差異。Meta分析發現MSC治療與發燒存在一定的關聯性,而與其他文獻所報導的不良反應沒有必要的聯繫。那麼發燒是否與培養基添加胎牛血清有關?有關聯,但是胎牛血清不是引起發燒的唯一因素。

為了避免與FBS相關的不良併發症,開發了可替代動物血清的培養基。最常用的是人AB血清(HABS)、人血小板裂解物(HPL)和化學限定培養基(CDM)。

然而,這些替代方案依然存在自身的局限性。HABS和HPL均存在病毒(HIV、HBV、HCV、梅毒等)汙染的可能性,而且不同批次之間有明顯的差異[20]。成人供者的HABS(血清)在保留MSC重要特性的情況下能否比FBS更能促進MSC增殖的作用是有爭議的[21-23]。

比如美國波士頓的塔夫茨-新英格蘭醫療中心的研究員發現人HABS在促進臍帶MSC增殖方面不如胎牛血清,而且HABS培養臍帶MSC容易成團(見下圖)。

人血小板裂解物(HPL)最近成為一種更受歡迎的人類產品,可以代替胎牛血清[22, 24]。血小板在冷凍/解凍過程中被激活,釋放多種生長因子,再通過離心以清除血小板小體。獲得的生長因子包括血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、胰島素生長因子-1(IGF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)等[24, 25],這些因子以劑量依賴的方式提高了MSC的增殖能力。添加5%的HPL的培養基在克隆形成效率和增殖能力方面優於10%FBS,從而提供了更有效的MSCs擴增[24]。

然而,一些研究顯示血小板裂解物的局限性,包括成骨或成脂分化能力降低[26],以及表面標誌表達改變和降低MSC的免疫抑制能力[20]。

此外,蛋白質組學分析表明,從外周血中獲得的HPL含有促炎因子CCL3和CCL5,這些因子可能影響MSC的功能[20]。和胎牛血清培養MSC相比,HPL培養的MSC出現免疫抑制功能減弱的情況[20]。

化學限定培養基(CDM)因為不含血清,能避免血清製品帶來的潛在風險。常見的CDM有RoosterNourish (Rooster Bio), Mesencult-XF(Stemcell Technologies), StemPro MSC SFM XenoFree (Invitrogen), MSCGM-CD(Lonza)等等。這些培養基中會添加許多生長因子來代替血清的功能,常見的生長因子有:血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、肝素結合表皮生長因子(HB-β)和胰島素生長因子-1(IGF-1)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等等[27]。也有研究發現這些生長因子能促進MSC增殖的同時,也促進MSC的成骨/成脂/成軟骨分化,導致不能很好地維持MSC的乾性[28, 29]。

同樣,化學成份限定培養基(CDM)也不完美。例如,StemPro MSC SFM(是第一個獲得FDA批准的這種類型的商業產品)能促進MSC高表達II類MHC分子HLA-DR,即MSC的免疫原性增高,從而導致免疫系統對MSC的快速清除[30]。也有研究顯示化學成份限定培養基STK2能延緩培養過程出現的複製衰老,衰老的MSC明顯少於含胎牛血清的DMEM培養基[31]。另外,本小編曾經比較過不同公司的無血清培養對MSC功能的影響,初步發現Corning和Gibco的無血清培養基對MSC的免疫抑制功能沒有影響,而MACS、Lonza和R&D公司的無血清培養基均損傷了MSC的免疫抑制能力(見下圖)。

很多MSC培養基配方中喜歡添加地塞米松或同類激素,確實地塞米松能促進MSC的增殖,而且不同濃度的地塞米松對MSC分泌生長因子譜有差異,但是不同濃度的地塞米松均能損傷MSC的免疫[32]。所以,如果打算用MSC來治療免疫性疾病,那真的不建議用地塞米松來擴增MSC。除非能找到方法抵消地塞米松的這種副作用,只保留其促增殖作用。

2. 氧分壓

骨髓間充質幹細胞的氧分壓約為1-7%[33-35],而脂肪組織的氧分壓為10-15%[36]。骨髓腔血管外的氧分壓遠遠低於動脈血管內的氧分壓。因此,在生理上,MSC更適合低氧分壓環境。

MSC在低氧(0.5-3%)條件下培養,可通過促進低氧誘導因子(HIF1α)的高表達,激活抗凋亡基因Akt、Bcl2,從而提高MSC輸入後的存活能力[37-39]和上調趨化因子受體CXCR4、CX3CR1,增強MSC的歸巢能力[40, 41]。

低氧環境能不僅促進細胞增殖,還通過降低caspase-3的酶活性而起抗凋亡作用,並通過增加MSC表達多種生長因子,比如HIFα和HGF等,增強MSC在血管新生方面的功能[42]。

在缺氧條件下培養MSC可提高其增殖能力,並減少培養過程中的自發分化[43]。而且低氧培養MSC並不會對MSC的免疫抑制功能有影響[44]。

但是低氧培養的一個問題,是為了維持低氧的環境,氮氣的消耗會非常快,培養成本和管理成本會相應增加一些。

3. 培養載體

雖然有多種生物材料支持MSC的生長,MSC的增殖過程中和生物材料有信息交流(見下圖)。

但是MSC在不同硬度的材料上培養,MSC能感知材料的硬度,從而導致其細胞形狀和功能有所差異[45-47]。軟質基質上的MSC可促進傷口癒合;相反,硬質基質會降低MSC對傷口的癒合功能,促進瘢痕增生[48, 49]。MSC在微載體上模擬3D培養,也能促進MSC的增殖,而且還能增加MSC表達心臟標誌基因(Gata4、NKX2.5、Tnnt2和MYH6)[50]。

到目前為止,許多新的培養材料包括由膠原、糖胺聚糖、甲基丙烯酸透明質酸、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯或海藻酸鹽製成的水凝膠,而且都可以製備成不同的硬度,以誘導MSC向某一特定方面培養[51, 52]。

聚-ε-己內酯,一種生物相容性和生物可降解的材料,支持MSC的增殖,同時保持其分化能力和分泌生長因子的功能,而且在這些「微載體」上的細胞可以直接植入體內,而不需要利用酶分離MSC和材料[53]。有趣的是,對溫度敏感的聚合物在水溶液中表現出可逆的溫度依賴性相變,這是一種獨特的特性,可通過外部溫度變化來控制MSC和聚合物材料的粘附和解離[54, 55]。基於整合素-肽結合的細胞粘附性、含肽的熱敏表面被設計成包含熱誘導的「開-關」,這種方法可以實現無胰蛋白酶消化MSC,基本上消除了酶介導的細胞損傷[56]。

在這些生物材料的基礎上,MSC可以2D平面培養(最常見的培養瓶或者培養皿),也可以附著在微載體上3D培養,各有利弊,滿足不同的需求。科學研究,可以追求漂亮的花式花樣。產業化應用,則量力而行,把握好利弊之間的平衡就好。

最後,用一張很好的圖來總結目前MSC的生產培養體系!

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