癌症幹細胞培養篩選一例:結腸癌幹細胞

根據腫瘤幹細胞理論，腫瘤細胞中存在一類具有幹細胞特性的細胞[被稱為腫瘤幹細胞（cancer stemcells, CSCs）或腫瘤起始細胞（cancer initiating cells, CICs）]，具有自我更新分化潛能，可不受外界調控形成惡性腫瘤， 往往是腫瘤復發的根源。近年越來越多研究證實了CSCs存在於多種實體瘤中，如腦膠質瘤、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌等。

國內學者發現，人腦膠質瘤細胞能在含生長因子的無血清培養基（serum-free medium, SFM）中形成細胞球，這種細胞球由於富集CSCs而被稱為腦CSCs球。雖然這種細胞的總體數量極少，但能瘤性克隆生長，從而產生不同表型的癌細胞亞群。目前認為CSCs是導致放化療後腫瘤復發的原因，因此，研究CSCs有利於更好地理解腫瘤復發、轉移和耐藥性產生的機制，從而制定更為合理的治療方案。

結腸癌是一種常見消化道惡性腫瘤，其惡性度較低，術後5年生存率較高，但是仍有40%～50%的患者因為復發而需放化療。研究CSCs可提高治療的針對性和有效性，具有更為實際的意義。本研究通過SFM培養HT29細胞系，克隆分離癌細胞亞群，並從形態學、分化、自我更新、交替培養以及細胞化學免疫等方面進行鑑定。

材料和方法

一、材料

所用試劑有雙苯醯亞胺(Hoechst)33342(Sigma公司)、鼠抗人異硫氰酸螢光素（FITC）-CD44單克隆抗體（BectonDickinson 公司），0.5%(質量分數)胰酶-乙二胺四乙酸（Trypsin-EDTA）(Gibc公司)、RPMI1640細胞培養液(Gibco公司)、DMEM/F12細胞培養液（Gibco公司）、重組表皮生長因子(EGF，PeproTech公司)、鹼性成纖維生長因子(bFGF，PeproTech 公司)、胰島素（Sigma公司）、B27 因子（Sigma公司）、牛血清清蛋白（BSA，Gibco公司）、胎牛血清（Sigma公司）、維拉帕米（verapamil，Sigma公司)、碘化丙啶(PI, Sigma公司)等。人結腸癌細胞株HT29由上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院內科實驗室保存。

二、方法

1. CSCs球細胞培養和誘導分化：SSM為含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，SFM由DMEM/F12(1:1)、B27 (1:50)、EGF (20 ng/mL)、bFGF (10 ng/mL)、4%BSA及1 mg/L胰島素組成。

將結腸癌HT29細胞接種於SSM中，傳代培養，待細胞處於對數生長期，用磷酸緩衝液（PBS）清洗，0.5% Trypsin-EDTA 消化，重懸於SFM中，臺盼蘭染色計數活細胞後，以5×105/mL濃度於SFM中進行傳代培養，置於顯微鏡下觀察HT29細胞在SFM中形成CSCs 球的過程。將於SFM中形成的細胞球重新置於SSM中誘導其分化，顯微鏡觀察細胞形態變化。

2. 流式細胞儀檢測：收集SSM組和SFM組分化前、後的HT29細胞及細胞球（0.05% Trypsin-EDTA消化，反覆吹打為單細胞懸液），0.5%Trypsin-EDTA消化，PBS漂洗並離心後重懸於PBS中，細胞計數約1×106/mL，鼠抗人FITC-CD44單克隆抗體標記，置於4 ℃孵育20 min; PBS洗2次後以流式細胞儀(FACSAria 流式細胞儀，BD 公司)檢測和分選。流式檢測均重複3次。

3. 雙苯醯亞胺33342染色檢測：選擇對數生長期的細胞，消化、漂洗並離心後，重懸於2 mL 含3%胎牛血清的RPMI1640培養液，密度1×106/mL，然後按5 μg/mL的終濃度加入雙苯醯亞胺33342，對照組同時加入維拉帕米至終濃度50 μg/mL，37 ℃、5 %CO2、飽和溼度培養箱中孵育90 min ,每15 min將離心管輕輕晃動1次，使染料分布均勻。4 ℃離心後去盡培養液，冰冷PBS衝洗2次，加入冰冷3%胎牛血清的RPMI1640培養液2 mL及PI，使其終濃度為2 μg/mL，上機分選。應用流式細胞儀（Epics Altra,Beckman Coulter 公司），去除PI 陽性死細胞，收集側群細胞（side population cells, SP） 和非SP（NSP）。

三、統計學方法

採用SPSS10.0 統計軟體進行數據分析，實驗結果用x±s表示，2組資料均數比較採用t檢驗，P

結果

1.無血清培養結腸CSCs球的形成和誘導分化實驗：無血清培養細胞球囊生長情況：HT29細胞接種於SFM中，24～48 h後產生少量體積較小、鬆散的懸浮腫瘤細胞球，而大部分細胞凋亡崩解，不能在SFM中生長。72 h後細胞球體積逐漸增大。1周後，部分細胞團較為鬆散，最終分解並凋亡，此為細胞黏附形成的細胞球；一小部分細胞團持續擴增，形成形態較為規則的細胞球, 輕輕晃動培養瓶可見不多的細胞球沉於培養瓶瓶底。球內細胞折光性好, 連接緊密, 不能準確區分細胞間界限。新形成的CSCs球較為規則，新生單個細胞常以「出芽」的方式連接在球體上（見圖1）。

2． 球囊傳代培養：細胞球傳代時通過0.05%胰酶消化法和機械吹打法分離成單細胞懸液，24～48 h單個細胞相互聚集連接成「樹枝狀」懸浮於SFM中，第3～4天形成不規則細胞球，第5～6天逐漸形成較為規則的細胞球。細胞球形態隨傳代次數增加而趨於規則。

3． 球囊細胞誘導分化：將於SFM中形成的結腸CSCs球重新置於SSM中後，第1天可見多數細胞球開始貼壁生長，但少數仍懸浮生長，第3天可見細胞球內細胞逐漸移行出細胞球，形成島狀細胞群，而懸浮生長的細胞球已不多見，隨著「細胞島」內細胞移出形成單層細胞貼壁生長，10 d後貼壁的單細胞層即可形成。

二、CD44 在HT29 結腸癌細胞系及懸浮培養細胞球中的表達情況

1. HT29 結腸癌細胞系中含有CD44+細胞：流式細胞儀檢測分析可見橫坐標為FITC 的螢光強度（標記鼠抗人CD44單抗）。檢測到結腸癌細胞系HT29中CD44+細胞比例為（44.18±2.18）%（見圖2A）。

2. 無血清懸浮培養可富集CD44+細胞：選擇第6天的腫瘤細胞球檢測無血清懸浮培養HT29細胞系所形成腫瘤細胞球，經鼠抗人CD44單抗標記後， 發現腫瘤細胞球細胞中CD44+細胞比例為（83.41±11.21）%（見圖2B）。SSM 組與SFM 組相比，CD44+細胞比例有統計學差異（P

三、HT29細胞中SP細胞的分選

以維拉帕米能否阻止雙苯醯亞胺33342染色判斷所分選的結腸癌細胞系HT29 中是否含有SP細胞。HT29中含有少量SP細胞， 比例為（3.82±0.08）%（見圖3A）；經過維拉帕米阻斷後，HT29中SP亞群細胞比例明顯減少，僅為0.34%（見圖3B），證實HT29中確實含有一定比例的SP細胞。

討論

CSCs學說最早在白血病研究中提出。在CSCs分選領域，目前有流式細胞儀分選及磁珠分選2 種主要方法，其中流式細胞儀可利用表面抗原標誌物或DNA染料進行分選。2007 年Ricci-Vitiani等從人結腸癌組織中分離和鑑定了表面標誌為CD133+的結腸CSCs，約佔細胞總量的2.5%。經鑑定發現具有幹細胞特性。然而，有學者發現每5.7×104個隱窩幹細胞中有1個結腸癌起始細胞，每262個CD133+的結腸癌細胞中有1 個幹細胞樣細胞，其倍數相差大於200倍，CD133作為結腸CSCs標誌的準確性受到了挑戰。近年來，乳腺癌及前列腺癌等上皮來源腫瘤中CD44+CSCs樣細胞的發現對結腸CSCs研究帶來新的啟示。Chu 等從人結腸癌原代細胞中分選得到CD44+細胞，並進行了克隆形成實驗及小鼠體內成瘤實驗等幹細胞生物學特性鑑定，進一步證明了CD44也是結腸CSCs的待選表面標誌物。

SP細胞是1996 年Goodell 等在研究經雙苯醯亞胺33342染色的小鼠骨髓時，通過帶有紫外激發裝置的流式細胞儀檢測雙波長分別為藍色和紅色螢光，分離出一小群細胞，這群細胞呈現雙苯醯亞胺33342低染，在流式二維分析點陣圖上呈現彗星尾狀微雨細胞主體的一側。這群細胞不僅表達造血幹細胞表面標誌CD34 及CD38, 而且僅正常量的千分之一即可重建骨髓造血系統，在隨後的研究中發現其具有幹細胞樣的特性，可作為分選幹細胞的新表型。Goodell等在研究中發現，SP細胞通過ATP 結合盒式蛋白（ABC）轉運家族中的多藥耐藥基因1（即MDR1 或ABCG2）泵出雙苯醯亞胺33342，在加入ABCG2 的抑制劑維拉帕米後，SP細胞數量明顯下降。

而在多種腫瘤組織及不同腫瘤細胞系中發現也有比例不等的SP細胞。目前在多種實體瘤細胞系中也發現少量具有幹細胞樣特性的SP細胞存在。在結腸癌的研究中，2006年Haraguchi等從多種已穩定建系的結腸癌細胞系中分離得到SP細胞，其含量佔總數的0.3%～0.7%。

然而，由於分離到的CSCs樣細胞數量太少，難以支持後續實驗的開展。國外學者在長期研究中發現， 加入EGF和bFGF的SFM有利於正常成體幹細胞的體外擴增。有學者在正常神經幹細胞研究中發現，將正常腦組織中的神經幹細胞在含EGF和bFGF的SFM中培養，在bFGF作用下具有bFGF反應性的神經幹細胞，不僅可以通過不對稱分裂進行自我更新保持自我，而且可生成具有EGF反應性的幹/祖細胞，而在EGF作用下具有EGF反應性的幹細胞，通過對稱分裂進行自我增殖，並通過不對稱分裂來生成具有bFGF反應性的神經幹細胞。總之，神經幹細胞在EGF和bFGF的作用下，可擴增數量並維持幹細胞多向分化潛能。

無血清培養不僅可用於正常幹細胞，CSCs在該條件下也可保持為分化狀態生長。乳腺癌、惡性神經系統腫瘤、結腸癌等惡性腫瘤細胞製成單細胞懸液，在不含血清僅含有EGF、bFGF的DMEM/F12培養基條件下，大部分分化的腫瘤細胞不耐受無血清環境在數天內死亡，而極少部分未分化的CSCs可生存並形成細胞球懸浮生長。這些細胞球富含CSCs，消化後可在含血清培養基中被誘導分化。因此，我們推測，選擇合適配比的SFM可有效富集CSCs， 再進一步可進行免疫法或表面標誌等方法純化CSCs。

CSCs球分化後的腫瘤細胞經免疫、細胞學檢測，與普通細胞系細胞無異。在本次研究中，我們改進了SFM配方， 在其中加入具有生長因子作用的胰島素以及血清的替代物B27、有利於細胞球形成。因此，經過改進的SFM對CSCs 球的生長速度、形成狀態、形成時間均更為有利。

在本次研究中我們發現， 採用了改進配方的SFM懸浮培養腫瘤細胞，大部分已分化的HT29細胞不能形成細胞球，並在1～2 d內凋亡崩解；而少數細胞以「出芽」方式逐漸由單個細胞形成細胞球，時間在3～5 d，並發現其細胞具有可不斷自我更新、增殖並分化的生物學特性。

研究中我們選擇了細胞表面抗原CD44來純化CSCs，CD44 是原始的、未分化的表面標誌。近年來，乳腺癌及前列腺癌等上皮來源腫瘤中CD44+CSCs樣細胞的發現對結腸CSCs 標誌物帶來新的啟示。本研究發現，CSCs球CD44高表達，而且其比例明顯高於SSM 中培養的普通HT29 細胞。我們認為HT29細胞中存在一定比例的CSCs，在SFM中CSCs可被富集並不斷擴增維持未分化狀態，這一發現為今後的進一步研究提供了一個平臺。

流式細胞儀分選CSCs 的方法自從在白血病研究中開始後廣泛應用於實體瘤CSCs研究中。本實驗中，我們發現結腸癌細胞株HT29種存在SP細胞，比例為（3.82±0.08）%，與文獻中其他結腸癌細胞株相比，這一比例較高（高於1%）， 有利於CSCs 研究的進一步開展。

綜上所述，HT29 細胞中確實存在一定比例的細胞，可在SFM中懸浮生長並形成CSCs 球，與SSM中培養的HT29細胞相比，腫瘤球細胞高表達CD44，且其在懸浮生長過程中表現出了幹細胞自我更新、無限增殖和分化能力的生物學特性。在HT29細胞中可檢測到一定比例的SP細胞。這為我們進一步研究結腸CSCs奠定了技術基礎。

轉載：無血清懸浮法培養結腸癌HT29細胞系及腫瘤幹細胞樣亞群篩選，《J Intern Med Concepts Pract》，如有侵權請聯繫刪除！