小球藻生長因子CGF為什麼稱為「高價值活性物質」

小球藻高價值活性物質研究現狀及展望

郭瑞雪 １ ，楊 友 ２ ，張詩雯１， Qureshi Shanidmoin１，顧嘉琦１，武彩霞１，劉進軍１，蘭金蘋 １

（１．河北北方學院 生命科學研究中心，河北 張家口075000；２．河北北方學院 經濟管理學院，河北 張家口075000）

摘要

微藻目前被認為是最理想的生物燃料、生物固碳及廢水生物修復的開發對象，其高附加值產品在醫學藥品、功能性食品、化妝品及新型餌料領域有著巨大的開發潛力和發展前景。以小球藻活性物質的功效為出發點，探討活性物質的主要成分、分離純化方法及其作用機理與生物學活性，分析小球藻產品商品化應用存在的問題，為今後開發應用小球藻高附加值產品提供理論基礎與科學依據。

關鍵詞

小球藻；活性物質；小球藻生長因子（CGF）；生物學活性

石油資源的日益枯竭及溫室效應的逐漸加劇，使得人類迫切尋求更加潔淨、綠色的可再生能源。與傳統生物能源作物相比，微藻具有分布廣、繁殖快、易培養、不與人爭糧、不與糧爭地、油脂含量高等特點［1］，二氧化碳固定率是C3植物的10餘倍［2］，且本身富含多種高價值、高營養化合物，如蛋白質、多糖、脂類、色素、維生素、微量元素等，因此，微藻目前被認為是最理想的生物燃料、生物固碳及廢水生物修復的開發對象［3-4］，而且是動物及人類健康的營養膳食添加劑［5］ 。一項經濟可行性研究表明，由於微藻生產成本的限制，生物燃料的開發並非物有所值，除非在生產生物燃料的過程中伴隨高附加值副產品的商業化生產［6］ 。若從提取油脂之後或高固碳後的藻中得到高附加值產品，即微藻能源、固碳過程與其保健品、健康產品及功能性食品的開發同步進行，不僅會大幅降低微藻能源的生產成本，而且將有不可估計的市場經濟價值。

小球藻（Chlorella）為單細胞綠藻，不僅是國內外正在大力發展和培育的微藻能源與固碳藻種之一，而且富含磷酸多糖［7］、天然色素［8］、多種類胡蘿蔔素［9］、ω-3脂肪酸及多酚［10］等多種高價值化合物，具有抗氧化活性、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等多種生物活性 ［11-12］ 。因此，小球藻作為可持續的自然資源代替合成的膳食添加劑，在預防、治療人類疾病方面具有潛在的應用價值。為確保可持續生產具有營養和健康效益的高價值產品，必須解決微藻的規模化培養和生物精加工過程。目前，筆者所在的實驗室前期工作中已經申請了２項專利，一是「一種微藻培養優化設備」［13］，能夠在規模化、條件化製備微藻的同時提升油脂產量及提高固碳效率；另一個是「一種微藻收集和濃縮的方法與裝置」［14］，解決微藻規模化培養難收集問題。最近，這２項專利已經應用到蛋白核小球藻 （Chlorella pyrenoidosaFACHB-9）的規模化工業生產中。

本文主要以小球藻活性物質的神奇功效為出發點，探討活性物質成分及作用機理、小球藻產品商品化應用存在的問題，為今後開發應用小球藻高附加值產品提供理論基礎與科學依據。

01、小球藻功能性食品及健康價值

戰爭年代因糧食匱乏，一些國家利用野生小球藻來充飢，從此，小球藻被開發作為人類食物資源，成為理想的穀物替代品。小球藻商業化種植始於２０世紀６０年代的日本和臺灣。20世紀80年代，美國、以色列、澳大利亞、中國和泰國開始大規模培養，小球藻成為主要的膳食添加劑。2013年，美國食品藥品監督管理局 （FDA）認證高產油的蛋白核小球藻Ｓ106為一般公認安全（GRAS）食品，市場上已有小球藻麵條、餃子、飲料等食品在售，其中獨有的活性成分是小球藻生長因子（chlorella growth factor,CGF），也稱為小球藻熱水提取物，含有豐富的營養物質，致使小球藻以每20ｈ增長４倍的速度繁殖，並且使乳酸菌呈４倍增值［15］。小球藻附加值以飼料形式餵食豬，比粗糧餵食組生長速度顯著增加，可提高血液中的ＩｇＡ 濃度及氮的代謝水平［15-16］。目前具有代表性的小球藻食品有日本Sun Chlorella公司的飲料、美國Shko's Natural pRroducts生產的 「CGF膠囊」、中國臺灣綠藻工業公司的 「綠寶CGF 」以及中國廣東綠安奇公司的 「綠藻精」系列產品。大量基礎及臨床研究發現，小球藻由於富含高質量蛋白質、亞麻酸、多糖、核苷酸、多肽、維生素和微量元素等多種物質，表現出抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎的作用，可顯著改善高血糖、高血壓及腫瘤病人的身體狀況［17-18］ 。

儘管小球藻有很多健康價值，但還有大量研究表明攝入過量的小球藻可引發嚴重不良反應，如過敏反應、噁心、嘔吐等胃腸道問題。2016 年召回的Soylent 產品因以小球藻藻粉為原料而引發過敏反應。另外，小球藻可誘發急性腎小管間質性腎炎，引起腎功能衰竭［19］。商業化的小球藻已經存在一定的不良反應，急需要開發適用於人類食用的新型藻種，此外，還有更多的生物活性化合物有待發現。因此，需開發一種檢測潛在的有害代謝物的方法以及從微藻中提取目標化合物代替整個生物質的流程。

2、小球藻活性物質分離提取及生物學活性

小球藻中含有豐富的蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸、多種維生素及必要的礦物質，還富含植物色素，如葉綠素、葉黃素等，其基本成分見表1 。

2.1蛋白質及多肽

蛋白質在藻細胞的結構和代謝中起著重要作用，是細胞膜結構及參與光合作用催化酶的主要成分。小球藻蛋白質與傳統來源的蛋白質在數量和質量上均不同。小球藻蛋白質含量很高，尤其是蛋白核小球藻可高達60%以上，此外，小球藻含有哺乳動物不能合成的必需胺基酸及優質蛋白質，如乳球蛋白、卵清蛋白等，其胺基酸組成高於世界衛生組織 （WHO）和聯合國糧農組織（FAO）頒布的用於人類營養的蛋白質標準，作為高蛋白食品來源，小球藻能夠迅速補充體能，因此被 FAO列為21世紀人類的健康食品［20］ 。

小球藻細胞壁堅硬，只有破壞細胞壁及細胞膜，使內容物釋放，才能提取蛋白質。破壞細胞壁的方法很多，其中高頻超聲法應用較廣泛，但並不能完全充分釋放內容物；酶解是一種非常有利的方法，它具有選擇性高、副產物少、操作溫度低的特點；還有許多其他方法裂解細胞壁，如鋯珠、酸或鹼處理、微波、脈衝電場等。但這些方法均會影響蛋白質提取的純度及活性。Zhang等［21］ 開發了乙醇浸泡、酶消法、超聲和均質技術相結合的方法，提取72.4%的小球藻蛋白質。從蛋白質中純化生物活性肽是提高生物活性的必要條件，活性肽是蛋白質混合物通過硫酸銨或有機溶劑消除脂肪、碳水化合物等成分而獲得。根據活性肽的分子量大小、疏水性和電荷等物理化學參數，可通過多種技術對其進行分離純化，如膜超濾法、尺寸排除色譜法、反相高效液相色譜法和離子交換色譜法等。其中，反相高效液相色譜法 （RP-HPLC）被認為是最有效的多肽純化方法。另外，電膜過濾技術也是一種常用的純化活性肽的方法，比膜過濾的選擇性更強，可根據電荷和分子量分離生物活性肽，且不需要施加壓力［22］。近年來。活性肽純化技術已經取得了一些進展，但其商業化生產仍然面臨著生產成本過高的挑戰，在生產過程中可能會引起肽結構的改變，導致生物活性減弱或喪失。因此，對活性肽進行純化時，需要同時考慮其有效性和經濟性。

小球藻蛋白質具有一定的生物學活性，Moris等［23］從小球藻中分離出一種蛋白質的水解物，通過激發Ｔ細胞依賴的抗體反應和促進遲發性過敏反應來增強機體的免疫作用。發揮作用的蛋白質水解物一般為活性肽，小球藻中鑑定的活性肽不多，其中Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Glu-Phe和Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp這兩段序列均表現出很強的抗氧化活性和DPPH自由基清除能力［24-25］。kO［24 ］等對小球藻經蛋白酶水解後得到的酶解產物的抗氧化活性進行了研究，發現其酶解產物能夠清除過氧化物、DPPH和 Oh-，同時能夠降低 AAPH引起的細胞凋亡和壞死，進一步證明了小球藻蛋白質具有清除體內自由基、延緩衰老的生物學活性。

人體血壓的調節涉及許多複雜的系統，市場上有不同種類的治療高血壓藥物，但多會引起不良反應，包括低血壓、血管性水腫、咳嗽、頭暈、頭痛、噁心和腎損傷等。因此，從自然資源中提取抗高血壓化合物具有重要的應用價值。研究發現，小球藻中含有的活性肽具有抗高血壓的神奇作用，從藻類活性蛋白中提取的Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe、Gly-Met-Asn-Asn--Leu-Thr-Pro和和Leu-Glu-Gln胺基酸序列能有效抑制人體血管緊張素轉換 （ACE）的合成。kO等［26］ 用小球藻的活性肽提取物對大鼠進行實驗，發現小球藻中序列為Val-Glu-Tyr 的胺基酸對自發性高血壓大鼠具有降壓作用，進一步證實了小球藻蛋白質水解物具有降低血壓上升的作用。

許多研究表明CGF中的蛋白質具有抗腫瘤的作用，對肝癌細胞、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞等多種癌細胞的增殖均有抑制作用。KUNT等［27］ 採用明膠酶譜法研究了小球藻外分泌物對人體明膠酶的抑制作用，利用 Western Blotting技術對 MMPs-1、 MMPs-2、MMPs-9蛋白質表達進行分析，發現小球藻蛋白質提取液可以上調TIMP-3 蛋白質表達，下調C-Jun蛋白質表達，進而抑制癌細胞中３種基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，對乳腺癌的治療有很大的應用價值。CGF 對肝癌細胞 HEPG2 的生長有顯著的抑制作用，Wang 等［ 28 ］ 採用低溫高壓提取、酶解、離子交換、凝膠過濾層析等方法在小球藻中分離出一種對肝癌細胞 ＨｅｐＧ２具有抑制活性的多肽CPAP。Tranaka等 ［29］ 用小球藻CK22藻株的糖蛋白提取物對小鼠進行試驗，結果顯示其對小鼠的自發性腫瘤轉移有抑制作用。

多糖的提取通常在熱水中進行，該方法具有簡單易行、易於擴展等優點，但耗時長、提取率低。此外，微波、超聲波和酶促萃取技術應用越來越多。多糖提取後需要一些純化步驟來去除幹擾物質，如利用溶劑甲醇：氯仿：水的混合物（4:2:1）對提取的粗糖進行純化，也可以使用膜分離法、離子交換法、尺寸排除色譜法和親和色譜法等物理方法純化。Mulchhandani等［30］採用高壓萃取、Sebag、乙醇沉澱、超濾分離的方法得到粗多糖，再用離子交換層析DEAE52和葡聚糖凝膠層析 Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－ １００ 對粗多糖進行分離純化，利用凝膠滲透色譜法對純化後的產物進行分析，得到多糖PS-1-4-2、PS-1-2-3 和PS-2-3-3，分子量分別為3.97×10、2.28×10和4.1×10Da。

小球藻活性多糖具有顯著的抗腫瘤作用，Sheng［31］等從小球藻中提取出CPPSＩa 和 CPPSⅡａ兩種多糖，由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和１種未知糖組成，其中CPPSＩa中半乳糖含量最高， CPPSＩa中鼠李糖含量最高，這兩種糖對肺癌 A549細胞均表現出良好的抗腫瘤活性。Ｓｕáｒｅｚ等 ［32］從小球藻熱水提取液中分離出一系列分子量不同但結構相似的磷酸化多糖，發現其具有刺激小鼠腹腔巨噬細胞合成一氧化氮（NO）的作用，並且高分子量的磷酸化多糖表現出的活性更高。進一步對多糖進行組分分析，顯示多糖主鏈為β－Ｄ－吡喃半乳糖－（１３）－β－Ｄ－吡喃半乳糖－（１３）－，從小球藻中分離出的阿拉伯多糖（47KDa）並未顯示出刺激小鼠腹腔巨噬細胞合成 ＮＯ的活性。施瑛［３３］ 研究了小球藻多糖的免疫活性作用，結果顯示小球藻中的多糖成分具有顯著的免疫調節作用，作用強度與所用多糖劑量有關。藻細胞中的硫酸鹽多糖（SPS）是研究最多的具有抗炎活性的碳水化合物，kang 等［34］發現從微藻中提取的硫酸－１－葡聚糖可以限制巨噬細胞 NO 和 PGL2的產生，對炎症的產生具有抑制作用。還有研究表明，從藻種提取的硫酸化－巖藻多糖可以通過與細胞核的表面結合而減少炎症的發生，對機體炎症的預防具有顯著作用［35］ 。

2.3、脂質

脂質是質膜的結構組成部分，中性油脂是多糖儲存的能量儲存體。小球藻的脂質分數主要是中性脂質，包括甘油酯、游離脂肪酸、類胡蘿蔔素 （如 β － carotene）和極性脂質，如各種磷脂和半乳糖脂類。藻細胞中的脂肪酸結構一般由C16和C18飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的混合物以及更長的碳鏈組成。飽和脂肪通常儲存在中性脂質中，而不飽和脂肪酸則主要與極性脂質存在於不同的膜中，在不同的培養條件下維持膜的流動性。

從藻細胞中提取脂質通常使用非極性有機溶劑或溶劑混合物，如氯仿 － 甲醇和己酮 － 異丙醇。提取後使用額外的處理步驟，包括分餾或冬化，將多不飽和脂肪酸 （PUFAs）從總脂類中分離出來。然而，由於含有雜質、氣味、味道和渾濁的外觀，仍然不適合人類食用，需要過濾、漂白、脫臭、拋光和添加抗氧化劑進一步淨化。值得注意的是，萃取過程中使用大量溶劑引起了人們對健康、安全和環境的嚴重關注。因此，需要在溶劑回收、用綠色溶劑取代傳統有機溶劑和執行更可持續的過程方面做出更多努力。從藻細胞中提取脂質通常使用非極性有機溶劑或溶劑混合物，如氯仿 － 甲醇和己酮 － 異丙醇。提取後使用額外的處理步驟，包括分餾或冬化，將多不飽和脂肪酸 （PUFAs）從總脂類中分離出來。然而，由於含有雜質、氣味、味道和渾濁的外觀，仍然不適合人類食用，需要過濾、漂白、脫臭、拋光和添加抗氧化劑進一步淨化。值得注意的是，萃取過程中使用大量溶劑引起了人們對健康、安全和環境的嚴重關注。因此，需要在溶劑回收、用綠色溶劑取代傳統有機溶劑和執行更可持續的過程方面做出更多努力。

長鏈多不飽和脂肪酸在多種炎症病理中具有治療作用，如阿爾茨海默病、關節炎和狼瘡。越來越多的動物實驗和體外實驗支持微藻油的抗炎特性。Nauroth等［36］報導，使用二十二碳五烯酸（DPA）可以抑制脂多糖 （LPS）刺激分泌白介素（IL）１β和幹擾腫瘤壞死因子－α（TNF－α）在人類外周血單核細胞中存在。與對照組相比，餵食含有DPA（佔總脂肪酸的１６％ ）和 DHA（佔總脂肪酸的40% ）的藻油的大鼠顯著降低了足水腫模型大鼠的炎症反應。Banskota等［37-8］也報導了含有單半乳糖二醯基甘油的脂質提取物對264.7個巨噬細胞的抗炎作用。此外，在飲食中使用微藻油，特別是富含omiga-3的脂肪酸，已被證明對偶氮甲烷誘導的結腸隱窩功能異常具有化學反應作用。CGF中含有的亞油酸、 γ-亞麻酸等多種脂肪酸，對降低血壓及血糖血脂也有顯著的作用，同時富含多種不飽和脂肪酸，其中的二十二碳六烯酸（DHA）被稱為「腦黃金」，可以促進腦細胞的生長發育，在保健產品及嬰幼兒奶粉方面有廣泛應用［39］ 。

2.4、色素

小球藻細胞中的總色素含量約佔 ４％～５％ ，其中包含葉綠素 ａ 、葉綠素 ｂ 以及類胡蘿蔔素。類胡蘿蔔素是包括脂溶性胡蘿蔔素和葉黃素在內的光合器官的組成部分，這些化合物可獲得光能，同時也可作為光保護劑來抵抗自由基和惡劣的環境條件，如強烈的太陽輻射和紫外線。類胡蘿蔔素是由各種相關色素以不同的比例自然產生的，利用其廣泛的作用可開發一系列高效益產品，有良好的發展前景和市場。

目前常見色素提取方法主要有有機溶劑浸提法、超臨界ＣＯ２法和吸附樹脂法。Kong 等［40］ 研究了超聲輔助提取法提取普通小球藻油脂分離葉綠素的方法，發現最佳提取參數為：提取溫度61.4 ℃ ，提取時間78.7ｍｉｎ ，乙醇體積79.4％ ，超聲功率為200Ｗ 。在此優化條件下，小球藻活性物質中的葉綠素含量可達 88.9％ 。

小球藻類胡蘿蔔素結構中存在大量的共軛雙鍵或特定基團，使其抗氧化活性明顯高於植物或合成類似物。這些化學基團通過清除活性物質中的自由基和單線態氧，將它們中和成危害性較小的分子，激活轉錄因子 Nrf2，繼而觸發抗氧化基因在特定細胞和組織中的表達。近年來，許多國家都致力於小球藻添加到化妝品領域的研究。藻細胞中維生素種類齊全，維生素 Ａ 能保護皮膚黏膜，維生素C可以分解皮膚中的黑色素，保持皮膚潔白細嫩，維生素 E能延緩皮膚細胞衰老。日本越來越多的化妝品加入藻粉及藻精成分，多功能面膜及美容美髮系列產品風行於美國、日本及西歐等國家。藻細胞中的類胡蘿蔔素可以延緩衰老，還具有抗炎特性，特別是蝦青素因其抗炎作用而受到廣泛關注。研究發現，蝦青素（劑量為100mg.kg-）的抗炎作用比普通抗炎藥物潑尼松龍（劑量為10mg.kg-1）更為明顯［41］ 。蝦青素還可以抑制 ＮＯ的生產，降低促炎細胞因子的水平，抑制腫瘤壞死因子和致炎細胞因子等 ［42］ 。藻細胞中的葉綠素不僅有促進肌膚新城代謝、延緩皮膚老化作用，在降低膽固醇、促進傷口癒合、治療缺鐵性貧血方面也具有顯著功效 ［43 ］ 。小球藻中的葉黃素能夠延緩慢性疾病的發生，同時還可以防止眼部疾病的發生並對心血管疾病也具有顯著的防治作用 ［44 ］ 。

3、小球藻開發存著的問題

小球藻活性物質和提取的高價值副產品目前被用於營養食品和功能食品，其提取物的生物活性和經濟價值已被廣泛認知。但小球藻生物量中有許多未定義的生物化學物質、潛在的毒素和重金屬，可能引起不安全消費並導致嚴重的健康狀況，這需要進一步研發活性物質的純化；另一方面，高價值的小球藻產品的供應受到生產總成本的挑戰，包括栽培系統和維護、有限的培養生產力和生物精餾過程。雖然露天池塘是大規模養殖最經濟的選擇，但它們更容易受到汙染，因此，如果所選菌株合成的有價值的產品能夠證明該系統的成本是合理的，那麼封閉的光生物反應器是首選。此外，收穫和提煉生物質也可能非常昂貴，而且成本在很大程度上取決於所選擇的過程。傳統的提取高價值代謝物的方法往往依賴於使用有機溶劑，產品中的殘留溶劑可損害健康。因此，超臨界流體萃取和酶解等綠色技術被認為是分離高價值藻類產品的新興技術。小球藻加工環節中的 「乾燥」和 「破壁」能耗過高，涉及到高溫、高壓等條件，制約其產業化。為了維持蛋白質等活性物質的功能，細胞解體應在溫和條件下進行，但會導致目標組分的提取率較低，故如何高效提取小球藻生長因子中的活性物質並進行產業化有待進一步探索研究。

4、結論與展望

小球藻活性物質在抑制腫瘤、抵抗炎症、防治慢性心血管疾病、增強機體免疫調節、防止氧化及延緩衰老等方面均表現出積極的生理作用，值得進一步研究和探索。小球藻在醫學藥品、功能性食品、化妝品及新型餌料領域有著巨大的開發潛力和發展前景，對藻類成分的探明及功能研究成果顯著。雖然小球藻大規模培養及產業化面臨許多挑戰，但市場上對藻類產品的需求促使科研工作者對藻類物質作進一步研究，並有望取得更大的突破。