基因組大片段缺失服務，來啦

七月水深，八月火熱，2020年總是這麼出其不意，令人難忘，但這一切並沒有阻止科研向前發展的腳步，就在剛剛過去的六月和七月，Cell和Plant Biotechnology Journal雜誌接連發表了關於基因組結構變異的研究，開創了植物研究新領域！

2020年6月17日，Cell在線發表了美國冷泉港實驗室Zachary B. Lippman研究組與約翰斯·霍普金斯大學Michael C. Schatz研究組合作完成的題為「Major Impacts of Widespread Structural Variation on Gene Expression and Crop Improvement in Tomato」的研究論文。該項研究利用單分子測序技術（ONT）獲得了100個番茄品系的基因組序列，建立了迄今為止最高精度、最為全面的植物結構變異全集，並揭示了結構變異在進化、馴化和育種中的重要作用。

圖1.基因結構變異對番茄基因表達和作物改良影響概述圖

2020年7月31日，德國吉森大學植物育種系Rod J. Snowdon研究組在Plant Biotechnology Journal上在線發表了題「Long-read sequencing reveals widespread intragenic structural variants in a recent allopolyploid crop plant」的論文。這項研究中，他們以甘藍型油菜為例，對具有廣泛結構變異的植物基因組進行了研究，證明了全基因組長讀段測序技術具有高效的檢測內源性基因組結構變異（Structural Variation，SV）的能力。利用長讀段測序技術揭示了油菜中分布廣泛中小型SV，發現高達10%的基因受中小型SV事件的影響，表明中小規模的SV可能是異源多倍體農作物中功能基因多樣性的主要驅動力。

那麼什麼是基因組結構變異？

基因組結構變異（Structural Variation，SV）是基因組DNA中大範圍的結構差異，大小從幾千個核苷酸到整個染色體。SV在很大程度上引起了基因組變異，當發生在基因的編碼序列中時，它們可能會影響蛋白質序列，從而影響蛋白質功能和穩定性。當包含一個或幾個編碼單元時，缺失或重複可導致基因拷貝數的變化。此外，有研究表明，SV可能通過破壞增強子-啟動子相互作用所必需的基因組結構而幹擾基因調控。

結構變異是一種重要的基因組序列差異，此前由於短序列測序技術的限制，我們對它的了解比較匱乏。近年來單分子測序技術的進步給我們提供了解決平臺。通過獲得很長的序列可以更準確的鑑定結構變異，SV的研究也將被推向一個新的高度。

在動物中SV研究的相對較早，2015年，在Cell雜誌上發表了一篇關於用CRISPR/Cas誘導SV的文章，該文章在這項研究中創新性地使用CRISPR/Cas技術，在小鼠中快速而有效地產生SV。

圖2.小鼠中為期10周的CRISVar基因工程

在這項研究中，研究人員在小鼠胚胎幹細胞（ESCs）中使用CRISPR/Cas技術，開發出一個技術流程——他們稱之為CRISVar (CRISPR/Cas-induced structural variants)，10周內能夠在小鼠中有效地產生缺失、倒位和重複。研究人員能夠在ESCs中使用CRISPR/Cas系統，靶定在1kb到1.6Mb之間的基因組間隔。

事實上，兩個合成的引導RNAs（sgRNAs）——靶定一個染色體上兩個不同位置，可以通過非同源末端連接（NHEJ）誘導染色體倒位和缺失。例如，Xiao et al（2013）通過向斑馬魚胚胎中直接注射sgRNAs和Cas9，從而誘導斑馬魚胚胎中1.5kb的缺失。同樣的，在HEK293或小鼠MEL細胞系中也獲得了更大的結構重排，包括缺失、插入和易位。

隨著測序技術的發展，越來越多的長片段被測序出來，SV逐漸進入人們的視野，由於SV對真核生物的性狀變化起著重要作用，而且可能比單核苷酸多態性具有更高的功能意義，因此對SV的研究熱潮只會增不會減。SV在植物領域的研究落後於動物，那麼在植物中如何進行研究呢，方法來啦。

近年來，CRISPR/Cas介導的植物基因組定點編輯技術在農作物基因功能研究和精準育種中發揮了重要作用，展現了廣闊的發展潛力和應用前景，但其只能在基因組特定位點產生隨機插入和刪除，精準的片段插入和替換的效率一直很低，極大地限制了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立更高效的植物基因組片段插入和替換技術體系。

2020年7月6日，Nature Biotechnology雜誌在線發表了來自中科院上海分子植物卓越中心逆境中心朱健康院士領銜的研究團隊題為「Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice」的研究論文。

由該研究採用修飾後的DNA片段作為供體，在水稻中建立了一種高效的片段靶向敲入和替換技術，高至50%的靶向敲入效率將極大地方便對植物的研究和育種。

圖3.用於ADHE的化學修飾DSODN序列

此外，2020年3月4日Oliver等在Nature Communications發表了題為「Marker-free carotenoid-enriched rice generated through targeted gene insertion using CRISPR-Cas9」的研究論文。他們利用CRISPR/Cas將5.2kb的無標記DNA片段定向插入水稻的兩個GSHs，獲得了類胡蘿蔔素含量高的水稻植株。

通過以上的介紹，我們了解到植物中基因組結構變異對植物的性狀具有重要的影響，以及植物中插入大片段以及實現片段替換的方法。基因組結構變異屬於植物學研究的新領域，伯遠生物一直秉著讓您在科研領域保持領先地位的態度，將為您提供基因組大片段缺失的服務，歡迎諮詢！我們的技術值得您期待！

參考文獻：

Alonge M , Wang X , Benoit M , et al. Major Impacts of Widespread Structural Variation on Gene Expression and Crop Improvement in Tomato[J]. Cell, 2020, 182(1).

Chawla H S , Lee H T , Gabur L , et al. Long-read sequencing reveals widespread intragenic structural variants in a recent allopolyploid crop plant[J]. Plant Biotechnology Journal, 2020.

Dong O X , Yu S , Jain R , et al. Marker-free carotenoid-enriched rice generated through targeted gene insertion using CRISPR-Cas9[J]. Nature Communications, 2020, 11(1).

Katerina, Kraft, Sinje, et al. Deletions, Inversions, Duplications: Engineering of Structural Variants using CRISPR/Cas in Mice[J]. Cell Reports, 2015.

Lu Y , Tian Y , Shen R , et al. Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice[J]. Nature Biotechnology, 2020.

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