HiFi reads，挑戰基因組組裝不可能

繼PacBio推出HiFi組裝的多個研究成果後，國內首篇基於HiFi組裝的基因組文章也於今年5月見刊Nature Communication[1]，開啟了HiFi組裝的新風潮，你是不是也心動了呢？上次小編給大家介紹了一些關於HiFi組裝的小知識，今天繼續和大家分享關於HiFi組裝的那些事兒~

為什麼要用HiFi reads進行基因組組裝？

所謂HiFi組裝，是從三代測序下機的原始Subreads中調取聚合酶繞插入片段圈數大於3圈的Subreads互相校正，獲得高準確度的HiFi reads用於基因組組裝。相對於CLR組裝的高深度（100X subreads），HiFi模式直接用高準確度的HiFi reads進行基因組組裝，較低的測序深度（25X）即可獲得高質量的參考基因組。因用於基因組組裝的數據量較小，組裝過程中所需的計算資源也較少。而且，由於HiFi reads本身具有較高的準確度，不再需要用二代數據對三代組裝的基因組進行校正（圖1），大大縮短了組裝周期。

圖1 HiFi組裝（a）和CLR組裝（b）流程圖

HiFi reads組裝有多快？

基於HiFi reads，PacBio用6 h、1 d和6 d時間完成了2.5 Gb、11 Gb及47.7 Gb超大基因組的組裝。如此亮眼的數據，你是不是也想擁有？近來，安諾生信的小夥伴利用25X的HiFi reads，僅用6 h就完成了某二倍體植物1.0 Gb大小基因組的組裝，3 d完成了4.8 Gb大小基因組的組裝，組裝周期大大縮短。

表1 HiFi組裝結果展示

註：表中玉米、燕麥、紅杉數據來源於2020年PAG大會及PacBio官方公布數據，某植物1和2為安諾項目經驗數據。

HiFi組裝基因組的連續性與CLR差別會不會很大？

相對於CLR模式30 Kb的插入片段，HiFi模式插入的DNA片段相對會短一些，測序產生的Subreads和用於組裝的CCS reads也相對會短。那麼，HiFi組裝基因組的連續性會不會不如CLR？安諾用實際項目經驗告訴您：並不會！普通二倍體植物的Contig N50多在10 Mb以上，多倍體植物的Contig N50也達到了8 Mb，基因組的完整性均在96.9%以上，HiFi組裝基因組完整性和連續性均可與CLR模式相媲美。

表2 HiFi組裝項目經驗

HiFi組裝基因組的單鹼基準確度有保障麼？

CCS reads本身經過孔內糾錯校正，單孔內CCS reads的準確度可達99%以上，再經過一定深度的數據覆蓋進行校正，基因組組裝、質量能夠達到更高。那麼，組裝基因組的單鹼基準確度究竟如何呢？近來，我們利用高深度的illumina短reads，以HiFi組裝的基因組作為參考基因組，來檢測基因組中的純合SNP數目，平均每668.8 Mb才檢測到一個SNP，單鹼基準確度達到了99.999%以上。可見，HiFi reads用於基因組組裝可有效保障基因組的準確度。

表3 單鹼基準確性統計

總 結

PacBio CCS模式作為目前唯一可提供高準確度長讀長的測序技術，可獲得測序精度99%以上的HiFi reads，以少量的數據（25X）為研究人員帶來準確且有價值的信息：不僅能夠為基因組組裝提供準確的序列信息，還使得後續的運算和分析的流程更為簡單，耗費的計算資源更少。

自推出三代測序以來，安諾基因先後引入了10臺PacBio Sequel和7臺PacBioSequel II，打造了先進的三代測序平臺，日均產出數據量超2 Tb，產品服務類型涵蓋了基因組組裝、人重測序、動植物重測序、全長轉錄組等多種三代測序產品，累計項目經驗800+。高質量的測序數據、快速的分析周期，安諾優達一直秉承客戶至上的服務理念，為合作夥伴提供更快速、更優質的三代測序服務，期待您的垂詢~

參考文獻

[1] Chen H, Zeng Y, Yang Y, et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa[J]. Nature Communications, 2020, 11(1)