【爾雲間】解析同源四倍體基因組的組裝

同源多倍體基因組一直以來是組裝界難以攻破的大boss，幸運的是，基於迄今可用的最佳技術（準確的CCS reads，Hi-C數據和allele-aware組裝算法），首次破譯了我國特有品種「新疆大葉」紫花苜蓿的四倍體基因組，成功地組裝出了所有等位基因染色體，該研究成果於2020年5月19日在Nature Communications期刊上發表。

紫花苜蓿由於其高品質的營養，高產和適應性，是多年生最重要的牧草種類。不但具有很高的飼料價值，還能改善適當地區的土壤質量。但由於其同源四倍體和自交不親和性等特點，給基因組組裝帶來很大的挑戰性，一直難易突破。下面，我們一起來看看這項研究是如何成功解決同源多倍體組裝的難題。

栽培的紫花苜蓿植物的新鮮的葉子，該植物種植於溫室中，溫度保持在21–23°C，每天光照16 h（380-450 W / m2的光照強度），相對溼度為70％。使用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）從這些葉片中提取DNA。DNA的一部分被送到AnnoRoad以構建環形共有序列（CCS）庫，並使用PacBio Sequal平臺對其進行測序，其他部分被送至Nextomicsto構建庫，並使用Nanopore ONT和Illumina Hiseq平臺對其進行測序。這些測序工作分別產生了70G的ccs數據（reads N50 12.6K）、99G的ONT數據（reads N50 21.58K)和126Gb Illumina數據 (Insert size 300bp)，用於從頭組裝栽培的紫花苜蓿基因組。

   從用於全基因組測序的植物中摘下新鮮的葉子和枝條，然後將樣品中的染色質交聯至DNA並固定。將固定的樣品發送到青島BGI（中國青島）進行Hi-C文庫的構建和測序。使用DpnII限制性核酸內切酶構建了兩個文庫，並獲得了200 Gbp的數據。

使用Trimmomatic默認參數質控Illumina數據。使用兩個文庫，每個文庫具有約56 Gbp的reads，通過SOAPec（v.2.01）軟體包中的Kmerfreq，基於K-mer 17的方法獲得的苜蓿基因組大小的估計值為〜3.15Gb(2n = 4x)；通過腳本計算得到雜合率為3.7%。同時，藉助流式細胞儀預估得到基因組大小為〜3Gb(2n = 4x)。

Kmer 17預估：基因組大小=總kmer數/覆蓋深度=59,975,196,680 / 19 = 3,156,589,298

流式細胞儀評估：M.sativa (cultivar XinJiangDaYe)和M.truncatula (cultivar Jemalong,A17) DNA峰比率推算（718/206=3.49）

（1）使用Canu默認參數，利用CCS clean reads組裝contigs。組裝得到的Contig N50值為459kb，總長度為3154Mb。（2）使用HiC-Pro將Hi-C reads與contigs 進行比對，產生比對BAM文件。（3）使用注釋的蒺藜苜蓿蛋白作為參考，完全基於同源的策略注釋contigs。對138,729個同源基因進行了結構注釋。用MCscan用於鑑定contigs和參考基因組之間的共線性。顯示紫花苜蓿和蒺藜苜蓿之間的高共線性。（4）使用內部腳本處理BAM文件，去除等位基因contigs之間的links。使用ALLHiC軟體，提取、聚類和重排Contigs (Contigs syntenic與蒺藜苜蓿染色體一致)，得到原始的scaffolds。（5）Juicebox用於以圖形和交互方式微調組裝的scaffolds。剪裁了40個總長度達1800Mb的scaffolds 。(6) 基於組裝的scaffold，通過Hi-C數據，每個unplaced contig被分配到互作最強的那些contig cluster裡。（7）使用ALLHiC對那些contig clusters再次進行重排和構建scaffold。（8）使用Juicebox對scaffolds進行微調，並從scaffolds上去除不一致的contigs，產生最終的染色體基因組，其包含32條染色體(8個同源組，每個組中有4個等位基因染色體)，總長度為2738Mb，和419Mb未掛載到染色體水平的序列。

ALLHiC算法主要步驟的概述 

染色體水平基因組統計

(1) BUSCO評估基因組完整性 

(2) 驗證scaffolding 的homologous group

參考遺傳圖譜比對到栽培紫花苜蓿的基因組，比對結果顯示組裝的紫花苜蓿基因組與參考遺傳圖譜基本一致。

(3) 檢查Hi-C互作矩陣進一步評估了組裝的質量。繪製的Hi-C linkage表明染色體組是清晰的

(3) 提取99Gb ONT數據的前200個最長的ONT reads，範圍從95到263 Kb，比對到組裝的紫花苜蓿染色體基因組上，其中大多數（89％）可以比對到一條長度超過其自身長度80％的單個染色體。證明大多數染色體的phased是正確。(4) 超過90％的組裝轉錄本可以定位到組裝的基因組上。

 在本項研究中，利用高精度的CCS 加Hi-C數據的策略，成功的組裝出同源四倍體基因組的所有等位基因染色體，儘管由於該物種本身具有四體遺傳的特徵，導致在分相過程中可能存在一些錯誤，但得到的染色體基因組在後續研究中仍具有非常重要的意義；另外，基於目前的技術，這種組裝策略是最有希望解決其他多倍體物種基因組組裝的問題。