大型基因組(Large Genome Size)研究策略與思路

隨著基因組測序技術的飛速發展，越來越多的動植物已經完成了全基因組密碼的破譯，小型基因組（Genome Size＜5 Gb）的研究可謂「雨後春筍，勢如破竹」，其研究成果發表於眾多知名期刊；於此同時，由於三代測序技術（PacBio）成本的大幅度下降，通量＞10000倍增加，讀長＞100倍提升（圖1），針對大型基因組（5 Gb≤

Genome Size＜10 Gb）或超大型基因組（Genome Size≥10 Gb）的組裝策略日臻完善，越來越多的科研工作者開展了超大基因組的動植物的研究工作，如裸子植物，兩棲爬行動物等。本期小編將為大家介紹下超大基因組的組裝策略及研究思路。

一、大基因組如何定義？

廣義上的大型基因組（Genome Size）通常指基因組大小超過5 Gb，多集中在裸子植物、兩棲動物、爬行動物類等。它們往往具有超高的重複序列，還兼具大量的雜合區域。如被子植物（開花植物）基因組大小相差達2400倍(1C = 0.063–148.8 Gb)，平均基因組大小為1C=5.7 Gb（圖2）。 

圖2 7542個被子植物中基因組大小（GS）分布的直方圖

以植物為例，植物DNA C-values資料庫（www.data.kew.org/cvalues）中提供的植物基因組大小（Genome Sizes，GS）的大規模數據比較分析表明，被子植物（開花植物）的GS多樣性顯著。植物基因組大小具有多樣性主要有兩個因素：(1) 多倍體或全基因組複製，引起了植物基因組大小的逐步增加：(2) 拷貝數的變化，可能導致植物基因組大小的變化；DNA重複序列在大多數植物中佔據基因組DNA序列的大部分，以幾百萬個拷貝的形式出現；隨著GS的增加，重複DNA序列比例在一定程度增加。

PacBio Sequel II平臺提供CLR library和HiFi library兩種測序模式。其中CLR library可提供超過75 Gb的長片段數據；HiFi library採用CCS方式獲取數據，可大幅提升長片段序列的單鹼基準確性。Circular Consensus Sequencing (CCS) read: 環形一致性序列，這種一致性序列通過對來自單個ZMW中的subreads進行比對產生。產生的CCS reads不包括或不需要與參考序列比對。產生的CCS reads使用CCS算法需要至少兩輪讀取來自插入片段的subreads，單條CCS read準確性可達99%。Sequel II System 2.0版本試劑使得HiFi文庫的插入片段長度提升至15-20 kb，從而更好的支持基因組從頭組裝；當使用15 kb HiFi文庫時，能夠獲得更好的變異檢測靈敏度和特異性；對於全長轉錄本以及長片段轉錄本的檢測能力得到提升（圖3）。

無論是PacBio CLR測序還是Nanopore測序，均有較高的錯誤率，常規小基因組物種，在高深度的三代測序數據的基礎上（通常為100x），可通過三代原始數據糾錯及二代數據polish等方式聯合，解決三代數據錯誤率高，以精準地獲得某小基因組物種的基因組密碼信息；但針對超大基因組物種，如裸子植物等，一般基因組≥10 Gb，利用常規策略（100x PacBio CLR或Nanopore），由於reads間相互糾錯及其耗時，周期長，投入成本巨大且組裝質量一般，已經成為了大基因組相關研究中的瓶頸，然而HiFi數據由於高準確性，無需繁瑣的糾錯過程，30X CCS數據即可完成基因組組裝，因此人工組裝費用較低、周期較快，組裝質量較好，能更好的組裝雜合性複雜的物種，使組裝的連續性更高，同時結合較長的讀長，可以跨越「惱人」的重複區，已成為了越來越多的基因組研究者的最佳選擇，如利用HiFi測序技術進行加州紅杉基因組組裝（圖4-5)。

比較基因組作為基因組研究中的固有思路，在基因組學研究常常加以引用。一般包含系統進化分析，分析時間研究，基因家族收縮與擴張研究，全基因組複製事件WGD研究及共線性分析等。在大型基因組的研究中，同樣不例外，可選取10-12個近源種和模式物種，對於其分化地位，物種分化時間，特異收縮擴張基因家族對其生物學功能的影響進行深入研究（圖6）。

重複序列是構成真核生物基因組的主要成分。其中轉座元件（transposable elements)是DNA重複序列的主要類型，幾乎再所有真核基因組中都普遍存在。因此基因組重複序列元件的研究尤其是大型基因組的研究中具有重要的意義與價值，如松柏類的大基因組（20-30 Gb）主要是由於轉座子的大爆發導致。2020年BioRxiv上報導了重樓屬植物七葉一枝花的基因組研究。其預估基因組大小約82.55 Gb，組裝獲得基因組大小70.18 Gb，該研究中對七葉一枝花的基因組重複序列進行了深入研究，發現在組裝獲得基因組中，69.53%為重複序列（57.86 Gb），其中62.50%（50.02 Gb)為LTR長末端重複序列。其重複序列含量低於銀杏(76.58%)，且高於玉米（64.00%）（圖7）。

 圖 7七葉一枝花基因組組裝結果及與其它代表性植物基因組特徵比較(Genome Size/LTR等)

在寬瓣重樓的研究中，選擇銀杏、玉米、水稻和擬南芥，使用逆轉錄酶基因的結構域構建Ty3/ Gypsy和Ty1/ Copia系統進化樹。Ty3 /Gypsy可以分為三個進化枝，每個進化枝包含銀杏，表明重樓基因組的Ty3/ Gypsy可能是從古老的裸子植物進化而來。發現重樓3個Ty3/ Gypsy進化枝顯著擴張，其插入時間顯示兩次爆發時間（2.2MYA和10.5-11.3MYA），表明所有Ty3/ Gypsy亞型都經歷兩次擴張Ty1/Copia分成5枝，4枝是重樓特有的，1枝是5個物種共有的（圖8）。

大基因組擁有大量轉座子，但是這些轉座子是否影響該物種的生理生化及生物學功能呢？明確轉座子與功能間關係將能對超大基因組存在具有理論意義。如蚯蚓基因組中重複序列LINE2轉座元件，顯著高比例地插入到蚯蚓早期再生相關的差異基因，同時某些差異表達的LINE2元件和它們的鄰近基因擁有極為相似的表達模式，因此LINE2轉座元件可能在蚯蚓再生中扮演著重要的調控角色（圖9）。 

群體進化研究是指通過獲得某物種自然群體各亞群的SNP、InDel等變異信息。然後基於群體變異信息，解析群體的遺傳多樣性、遺傳結構、基因交流情況、物種形成機制以及群體進化動態等生物學問題，從分子層面深入研究該物種的進化歷程。同時種群歷史動態是分子進化研究的另一核心內容，可用於闡明過去的地質氣候變化以及人類活動等歷史事件對當前物種分布的影響，同時也有助於制定合理有效的瀕危物種保護策略。通過對分子標記在種群歷史動態研究中的一些應用案例進行分析，探討了當前此項研究中存在的問題，揭示了今後的發展趨勢。在植物大型基因組的研究中，如裸子植物等，可結合相應的群體材料，對該物種不同群體材料進行深入研究（圖10-11）。

在大型動植物基因組的研究中，可根據某動植物物種本身的生物學特性，採用相應的生物學技術手段，對該物種生物學特性進行深入研究，如植物（大蒜大蒜素，寬瓣重樓多葉素等，圖12-13）、動物（蚯蚓，蠑螈再生機制等，圖14）的研究中，可結合代謝組學，單細胞組學，轉錄組等研究手段，對物種的生物學特性進行深度剖析。 

圖12 大蒜大蒜素代生物合成通路分析      圖13 七葉一枝花多葉素生物合成分析

 圖14 蚯蚓再生機制單細胞轉錄組研究

五、百邁客大基因組研究經驗

百邁客自2015年國內首家引進PacBio三代測序平臺，在基因組研究領域已經有近百餘篇合作文章發表於世界知名期刊，累計影響因子600+；隨著PacBio測序平臺的不斷升級，百邁客在基因組組裝研究中，不斷進行技術的迭代更新，在複雜基因組的組裝研究中獨具優勢，目前已有大量的多倍體複雜物種基因組見刊，如芥菜，棉花，花生，甘蔗，金魚等（圖15），同樣在大基因組物種研究中也積累了豐厚的經驗（見下表），並一直秉承著「致力於成為最具專業的基因組組裝專家」這一口號，在擁有國際上最具全面三代測序平臺的（PacBio和Nanopore）的基礎上，根據廣大科研工作者的不同需求，推薦最佳的基因組組裝策略，歡迎諮詢！

表 百邁客大基因組組裝經驗（部分）

六、參考文獻

1. Dodsworth S et al. Genome size diversity in angiosperms and its influence on gene space. ScienceDirect (2015).

2. Sun X et al. A chromosome-level genome assembly of garlic (Allium sativum L.) provides insights into genome evolution and allicin biosynthesis. Molecular Plant (2020).

3. Li J et al. An enormous Paris polyphylla genome sheds light on genome size evolution and polyphyllin biogenesis. BioRxiv (2020).

4. Shao Y et al. Genome and single-cell RNA-sequencing of the earthworm Eisenia andrei identifies cellular mechanisms underlying regeneration. Nature Communications (2020).

5. Salojärvi J et al. Genome sequencing and population genomic analyses provide insights into the adaptive landscape of silver birch. Nature Genetics( 2017).

文：雨文

排版：市場部

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