萊斯大學《科學》子刊模塊化，組織特異性和生物降解水凝膠交聯劑

【前言背景】

出於多種原因，聚合物水凝膠非常適合組織工程和其他生物醫學應用，包括它們為細胞提供的水合環境及其可調節的理化性質。這些水凝膠中使用的合成聚合物包括熱敏性聚（N-異丙基丙烯醯胺）（PNIPAAm）（在高於其較低的臨界溶液溫度時會發生物理膠凝），以及聚乙二醇（PEG）和各種其他聚醚，聚酯的衍生物。這些聚合物可以交聯形成高度組織化的網絡，該網絡因吸水而膨脹以填充組織缺損部位並為細胞提供支架。化學交聯對於維持形成後水凝膠的完整性是必不可少的，而熱響應性聚合物（例如PNIPAAm）必須經常進行交聯以防止水凝膠因被稱為脫水收縮的鏈壓縮而崩潰。此外，儘管已經為組織工程開發了許多水凝膠和合成交聯劑，但是這些系統在很大程度上是生物惰性的，因此需要進一步修飾以產生組織特異性生物活性，這是發展所需組織表型的關鍵前提。

引入水凝膠生物活性的方法包括遞送組織特異性生長因子和肽，以及使用生物活性大分子（如糖胺聚糖）作為水凝膠材料。例如，組織特異性生長因子（例如來自轉化生長因子-β超家族的那些）通常通過從中間血管（例如明膠微粒）中受控釋放來傳遞，以促進骨骼和軟骨的再生。或者，可以將這些組織特異性生物分子直接與水凝膠偶聯，以產生生物活性線索的原位呈遞，並降低生物分子擴散引起的異位效應的風險。

【科研摘要】

合成水凝膠因其可調節的理化特性而在組織工程中進行了廣泛研究，但具有生物惰性，並且缺乏產生適當生物學反應的組織特異性線索。為了向這些水凝膠引入組織特異性的生化線索，萊斯大學Antonios G. Mikos教授團隊開發了一種模塊化水凝膠交聯劑，poly(glycolic acid)–poly(ethylene glycol)–poly(glycolic acid)-di(but-2-yne-1,4-dithiol)（PdBT），只需在室溫下將PdBT與適當的生物分子在水中混合，就可以用基於小肽的線索和大分子線索進行功能化。軟骨和骨特異性PdBT大分子單體是通過與軟骨相關的疏水性N-鈣粘蛋白肽，親水性骨形態發生蛋白肽和軟骨衍生的糖胺聚糖，硫酸軟骨素進行功能化而生成的。這些生物功能化的PdBT大分子單體可以自發地交聯聚合物，例如聚（N-異丙基丙烯醯胺），以生產適用於間充質幹細胞封裝的快速交聯，高度溶脹，細胞相容性和可水解降解的水凝膠。這些優越的性能，再加上PdBT的模塊化設計和易於功能化，為其在組織工程應用中的使用奠定了強大的潛力。相關論文Modular, tissue-specific, and biodegradable hydrogel cross-linkers for tissue engineering發表在科學雜誌《Science Advances》上。

水凝膠交聯劑的合成與表徵

作者開發了一種新穎的名為PdBT的水凝膠交聯劑，可用於組織特異性提示的功能化。PdBT具有模塊化組件，包括用於生物共軛的炔烴部分，用於交聯的正交巰基末端和用於水解降解的可調聚酯嵌段（圖1）。

圖1：用於組織特異性生物分子的點擊結合的模塊化水凝膠交聯劑。

使用可商購的試劑通過三嵌段PGA-PEG-PGA上羥基末端的甲磺酸酯活化來合成PdBT，然後使用but-2-yne-1,4-dithiol對甲磺酸酯基進行親核取代（圖2A）。我們使用1H核磁共振（NMR）確認了PdBT的預期化學結構（圖3），並通過與圖1中的起始原料的1H和13C NMR光譜相關聯進一步確認。作者首先通過根據中心PEG鏈上預期的質子數將左峰「d」設置為89.27H來校準1H NMR峰積分（圖3）。峰「a」代表賦予水解降解性的PGA重複單元，峰積分顯示每條PdBT鏈平均〜7.57個PGA單元，大致相當於單體進料比預期的8個PGA單元。根據峰「a」至「g」的NMR分析，PdBT的分子量約為1562 Da，凝膠滲透色譜（GPC）表徵顯示的近似數均分子量（Mn）值為1381±74 Da，多分散指數（PDI）為1.09±0.03（n = 3）。峰「 e」和「 f」代表末端炔烴部分上的質子，充當每個PdBT鏈一個或兩個生物分子的點擊綴合的位點。峰「 g」對應於用於親核性交聯反應的末端巰基。在本文描述的模型水凝膠系統中，使用自發硫醇-環氧反應通過PdBT交聯P（NIPAAm-co-GMA）（圖2）。

圖2交聯的生物功能化水凝膠的產生。

圖3使用1 H NMR確認PdBT結構。

單擊功能化的PdBT

接下來，通過在水中進行便捷的混合過程，使用具有不同大小和親水性的幾種特定於骨骼和軟骨的生物分子，對PdBT進行了生物功能化。PdBT可通過親水性骨形態發生蛋白模擬物（BMPm）肽，參與軟骨形成的疏水性N-鈣黏著蛋白（NC）肽或軟骨衍生的糖胺聚糖大分子硫酸軟骨素（CS）進行功能化。通過已建立的固相肽合成程序合成了具有疊氮化物官能化N末端的BMPm和NC肽，而CS則如前所述用疊氮化物部分進行了修飾。PdBT的所有生物功能化反應均在環境溫度下進行，並在0.1摩爾當量（eq。）Cp * Ru（cod）Cl的存在下，將目標生物分子與PdBT以2：1摩爾比混合8小時進行和4摩爾當量二硫蘇糖醇（DTT）分別用於催化和二硫鍵抑制（圖2B）。然後，通過在H2O中透析24小時來去除雜質和未反應的試劑。CS/PdBT的合成產率非常高，為87.1％，而BMPm/PdBT和NC/PdBT的合成產率分別為65.0和58.7％。

通過比較相對於內標的反應前後疊氮化物相鄰1H NMR峰的峰大小來量化疊氮化物基團的轉化，表明CS/PdBT的轉化率為83.3％，BMPm的轉化率為82.1％，NC/PdBT的轉化率為89.7％（圖4，A至C）。因此，所有生物分子的高轉化率都與該反應的點擊性質相符。

圖4 CS，BMPm和NC生物分子與PdBT的點擊偶聯。

與結合PdBT的生物分子相比，GPC用來表徵未結合的生物分子的分子量分布，並且在所有三種生物分子的點擊綴合後，Mn均增加（圖4D）。例如，CS和CS/PdBT在點擊共軛後顯示出Mn的統計學顯著增加，從23.5±2.0增加到38.1±3.3 kDa，這對應於兩條CS鏈與單個PdBT大分子單體的結合所產生的CS鏈延長（圖2B）。類似地，BMPm和NC肽在綴合後顯示出Mn和PDI的統計學顯著增加，這與通過將兩種肽附著到每個PdBT大分子單體上產生的預期分子量增加大致一致（圖4D）。因此，1 H NMR和GPC數據表明PdBT可以與親水和疏水肽以及大型生物大分子綴合，為具有化學和物理性質的生物分子的生物綴合建立了概念驗證。

生物功能化PdBT的水凝膠交聯

接下來，建立了PdBT，CS/PdBT，BMPm/PdBT和NC/PdBT作為功能性10％（w/v）P（NIPAAm-co-GMA）水凝膠系統的水凝膠交聯劑（圖2C）。如果將PNIPAAm基凝膠化學交聯，則將其放入磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中時會因吸水而膨脹，但如果交聯不足，則會通過脫水收縮壓實並排出水團，這使該水凝膠系統成為一種簡便的模型用於評估PdBT和生物功能化的PdBT大分子單體作為水凝膠交聯劑的性能。因此，本研究的目的是確定與水凝膠形成時的初始溶脹率相比，在平衡時產生更大溶脹率的PdBT，CS/PdBT，BMPm/PdBT和NC/PdBT濃度。高度溶脹，高度交聯的水凝膠。對於這項研究，測試了每個交聯大分子單體的最大可溶濃度，以及在PBS（pH 7.4）中以1：3和2：3的稀釋度（圖5A）。3.5％（w/v）PdBT，4.66％（w/v）CS/PdBT，10.5％（w/v）BMPm/PdBT和3.5％（w/v）NC/PdBT或更高的濃度具有統計學意義變形後膨脹的程度（圖5A），代表了良好交聯的系統。因此，將用於形成良好交聯體系的最低濃度用於所有進一步的水凝膠表徵。如硫醇-環氧交聯反應產生的熱釋放的差示掃描量熱法所顯示，所有四個水凝膠交聯反應均在約60分鐘內完成（圖5B），表明生物分子共軛並未明顯幹擾PdBT的快速反應。交聯動力學。

圖5 PdBT交聯水凝膠的溶脹，反應動力學，水解降解和細胞相容性。

參考文獻：

DOI: 10.1126/sciadv.aaw7396

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