Nature綜述：微生物構成的氮循環網絡

微生物構成的氮循環網絡

The microbial nitrogen-cycling network

翻譯：翟志文 中科院遺傳發育所

責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所

Nature Reviews Microbiology, [31.851]

https://doi.org/10.1038/nrmicro.2018.9

Published: 05 February 2018

第一作者：Marcel M. M. Kuypers

通訊作者：Marcel M. M. Kuypers [e-mail]

合作作者：Hannah K. Marchant and Boran Kartal

作者單位: 德國，柏林，馬普海洋微生物研究所

主編按：能發表在30分以上的綜述，都是閱讀了500-1000篇文獻，大牛花了整年的時間，總結的教科書級別的學習材料，相關領域的學生有必要多讀幾遍。目前此文發表僅20個月，Google統計引用151次。而且氮是任何生命的重要元素，無論你研究的對象是動物、植物、微生物或環境，相信有本文氮循環的背景知識，定會讓你文章的結果和討論增色不少。

一作和兼通訊作者Marcel Kuypers，目前發表本領域是相關文章176篇，其中包括Nautre、Science、PNAS等眾多頂級期刊，引用達1.8萬次，H指數高達67。

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大綱

Outline

摘要

Abstract

氮是所有生物的重要組成部分，也是限制我們星球上所有生命體的主要營養成分。目前為止，可自由獲得氮的主要來源是大氣中的氮氣，但是大部分生物是依賴生物可利用的氮形式來生長，比如銨鹽和硝酸鹽。而這些基質的可利用性是依賴於不同的氮轉化反應，這些氮轉化反應是由具有多種多樣新陳代謝功能的微生物構成的複雜網絡而實現的。本綜述在目前獲得的新研究和新發現的背景下，對當前由微生物參與的氮轉化過程進行描述，包括這些微生物構成的氮轉化反應，參與氮轉化的微生物以及它們的生理和環境功能，也對那些並未發現但可能會發生的反應進行了描述。此外，我們對由氮轉化微生物之間的相互作用而構成的複雜網絡和其對全球生物化學氮循環的影響進行了討論。

Nitrogen is an essential component of all living organisms and the main nutrient limiting life on our planet. By far, the largest inventory of freely accessible nitrogen is atmospheric dinitrogen, but most organisms rely on more bioavailable forms of nitrogen, such as ammonium and nitrate, for growth. The availability of these substrates depends on diverse nitrogen-transforming reactions that are carried out by complex networks of metabolically versatile microorganisms. In this Review, we summarize our current understanding of the microbial nitrogen-cycling network, including novel processes, their underlying biochemical pathways, the involved microorganisms, their environmental importance and industrial applications.

亮點

Key points

• 氮是所有生物的基本組成部分，也是限制地球生命的主要營養物質。

  其可用性取決於微生物進行的多種氮轉化反應。

Nitrogen is an essential component of all living organisms and the main nutrient limiting life on our planet. Its availability depends on diverse nitrogen-transforming reactions that are carried out by microorganisms.

• 氮轉化微生物在代謝上是多功能的，這使得它們的分類僅僅局限於硝化器、反硝化器和類似的類別。

Nitrogen-transforming microorganisms are metabolically versatile, rendering their classification as mere nitrifiers, denitrifiers and similar classes inadequate.

• 經典的氮循環是不可能存在的，它由不同的過程以有序的方式相互遵循組成。

  在自然界中，微生物形成了連接氮轉化反應的複雜網絡。

The classical nitrogen cycle consisting of distinct processes that follow each other in an orderly fashion does not exist. In nature, microorganisms form complex networks that link nitrogen-transforming reactions.

• 微生物氮轉化網絡會減弱和加劇由人類引起的全球變化。

  它們產生和消耗強大的溫室氣體一氧化二氮(氧化亞氮，N₂O)，導致水生系統富營養化，同時從廢水中去除氮。

Microbial nitrogen-transforming networks both attenuate and exacerbate human-induced global change. They produce and consume the powerful greenhouse gas nitrous oxide, lead to eutrophication of aquatic systems and, at the same time, remove nitrogen from wastewater.

• 還有許多未發現的氮轉化反應是熱力學上可行的。

  催化這些反應的微生物以及相關的生化途徑等著我們去發現。

There are still many undiscovered nitrogen-transforming reactions that are thermodynamically feasible. The microorganisms catalysing these reactions and the involved biochemical pathways are waiting to be discovered.

名詞解析

• 還原劑：

  氧化還原反應中的給電子供體化合物。

Reductants：The electron-donating compounds in a redox reaction.

• 產氧光養生物：

  從光中獲取能量並利用水作為電子供體，形成分子氧和糖作為產物的生物。

Oxygenic phototrophs: Organisms that obtain energy from light and use water as the electron donor, forming molecular oxygen and sugar as products.

• 細菌細胞：

  動物體內含有內共生細菌的特殊細胞。

Bacteriocytes: Special cells in animals that contain endosymbiotic bacteria

• 奇古菌門：

  含有氨氧化古細菌的門。

Thaumarchaeota: The phylum that contains the ammonia-oxidizing archaea.

• 嗜酸性：

  生物體在酸性環境中生長的傾向（pH < 6）。

Acidophilic：The propensity of organisms to grow in acidic environments (pH <6).

• 甲烷：

  轉化生物氧化甲烷以保存能量。

Methanotrophs: Organisms that oxidize methane to conserve energy.

• NC10：

  以澳大利亞納拉伯洞穴命名的一個候選細菌門，包含「甲基假絲酵母oxyfera」，這是第一個發現的進行甲烷氧化和氧反硝化的有機體。

NC10：A candidate bacterial phylum, named after the arbor Caves in Australia, that contains 『Candidatus Methylomirabilis oxyfera』, which is the first organism discovered that performs methane oxidation coupled to oxygenic denitrification.

• 反能：

  需要能量輸入的反應。

Endergonic: A reaction that requires energy input.

• 疣菌門：

  一種細菌門，僅有少數被描述的物種，其中一些似乎在甲烷循環中很重要。

Verrucomicrobia: A bacterial phylum with only a few described species, some of which appear to be important in the methane cycle.

• 缺氧光致養生物：

  這些微生物從光中獲取能量，並用硫化氫等化合物代替水作為電子供體，因此不產生分子氧。

Anoxygenic phototrophs: These microorganisms obtain energy from light and use compounds such as hydrogen sulfide instead of water as an electron donor and thus do not produce molecular oxygen.

• 富營養化：

  營養物質的增加，導致藻類或藍藻過度生長。

Eutrophication: An increased input of nutrients that leads to excessive growth of algae or cyanobacteria.

• 質子動力：

  質子位錯在細胞膜兩側產生電荷和酸鹼度的差異，從而產生一個電化學電位，用於節能。

Proton motive force: Proton dislocation creates a difference of charge and pH between two sides of a cell membrane and thereby generates an electrochemical potential, which is used for energy conservation.

• 厭氧汙泥硝化器：

  在廢水處理過程中產生的多餘微生物生物量（汙泥）厭氧轉化為二氧化碳、甲烷、銨和還原硫化合物的生物反應器。

Anaerobic sludge digesters: Bioreactors in which excess microbial biomass (sludge) produced during wastewater treatment is anaerobically converted to carbon dioxide, methane, ammonium and reduced sulfur compounds.

• 初級亞硝酸鹽最大值：

  在透光區底部亞硝酸鹽濃度的峰值。

Primary nitrite maxima: The peak in nitrite concentrations at the base of the euphotic zone.

• 一氧化氮歧化：

  兩個一氧化氮分子歧化成一個分子氧和一個分子二氮氣體。

Nitric oxide dismutation: Two molecules of nitric oxide are disproportionated into one molecule of molecular oxygen and one molecule of dinitrogen gas.

• 化合作用：

  兩種反應物中含有同一種元素，氧化狀態不同，反應生成一種氧化狀態單一的產物的化學反應。

Comproportionation: A chemical reaction in which two reactants containing the same element with a different oxidation state react to create a product with a single oxidation state.

• 厭氧氨氧化菌：

  在厭氧氨氧化菌（anammox）中發現的一種細菌細胞器，是唯一已知的原核膜結合結構，在細胞分裂時被均分為子細胞。

Anammoxosome: A bacterial organelle found in anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria that is the only known prokaryotic membrane-bound structure that is equally divided into daughter cells upon cell division.

• 放能：

  產生自由能的反應。

Exergonic: A reaction that results in the release of free energy.

• 歧化反應：

  一種化學反應，其中一種反應物被分成兩種，含有相同的元素，具有不同的氧化狀態，一種被氧化，另一種比反應物還原。

Disproportionation: A chemical reaction in which a reactant is split into two species containing the same element with different oxidation states, one more oxidized and the other more reduced than the reactant.

背景和內容概述

氮是所有生物體不可缺少的組成元素，也是合成蛋白質和核酸等關鍵細胞化合物的必要物質。大氣中的氮氣是可自由獲得氮的最大庫存，從生物學上來講，它具有高度多樣的可利用性，然而能夠固氮的細菌和古生物菌是很少的。而其他生物體卻必須依靠如銨鹽和硝酸鹽這種性質活潑的含氮物質來提供生長，可這些生物可利用的氮在許多環境中是罕見的。這些限制性營養鹽的可獲得性主要是通過由微生物參與的、能夠改變氮氧化狀態的反應來控制。

由於工業氮肥的高投入量，導致人類活動對生物可利用氮的數量產生了極大的影響，人類生產的50%的食物需要依靠工業氮肥，這種氮肥的使用和豆科植物的種植幾乎使向陸地和海洋生態系統中的氮輸入量增加了一倍。因此為了預測這種氮輸入的後果，我們迫切地需要了解由微生物構成的氮轉化的基本機制。

由微生物形成的氮轉化的過程通常被描述為由六個有序進行的不同反應過程組成的一個循環。這種觀點認為一個氮氣分子(N₂首先通過固氮作用變成氨氣，氨氣經過同化吸收作用而轉變成生物有機氮，有機氮再經過氨化作用轉變成銨鹽，而銨鹽再通過硝化作用被氧化成硝酸鹽（NH₄⁺→ NO₂^-→ NO₃^-），最終再經反硝化作用被還原為一個氮氣分子（NO₃^-→ NO₂^-→ NO → N₂O → N₂）或者經厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidatio)作用被還原為一個氮氣分子（NO₂^-+ NH₄⁺→ N₂）。事實上，在氮循環過程並未達到上述所描述的一個平衡狀態，反而是與這六個過程中截然不同的氮通量的大小有關（Box 1）。

氮轉化微生物一般按其所涉及的六個過程之一進行分類：硝化器進行硝化；反硝化器、反硝化；固氮器、固氮；等等(Nitrogen-transforming microorganisms are generally classified according to one of the six processes they are involved in: nitrifiers carry out nitrification; denitrifiers, denitrification; nitrogen-fixers, nitrogen fixation; and so on)。過去十年來收集的基因數據揭示了參與氮轉化的微生物實際上存在巨大的多種多樣的新陳代謝功能。現在我們知道很多微生物可以同時發生固氮和脫氮作用。因此，由於它們代謝的多樣性，幾乎不可能再根據氮轉化過程中經典的六個過程來劃分這些微生物。故在本文中，我們將使用過程的名字，比如反硝化作用denitrification和硝化作用nitrification,，而避免對微生物進行相應的分類。這篇綜述集中在氧化還原反應，轉化氮化合物，生化途徑，以及負責的酶（圖1）和微生物。

根據我們目前的理解，微生物可通過14個離散型的氧化還原反應改變從-3價態到+5價態的含氮化合物（圖1），有機氮和氨氣之間的相互轉化中氧化還原狀態不變。氮轉化有關的酶經常在不同的微生物中被發現，而且這裡包括的很多酶還是最近才被鑑定出來的。在過去的十年裡，有四種新的反應被研究學者發現，它們分別是：羥胺氧化為一氧化氮的反應（hydroxylamine oxidation to nitric oxide，圖1，反應7）；一氧化通過歧化作用轉變成氮氣和氧氣的反應（nitric oxide dismutation to dinitrogen gas and oxygen，圖1，反應9）；聯氨的合成反應（hydrazine synthesis，圖1，反應13）；聯氨氧化成氮氣的反應（hydrazine oxidation to dinitrogen gas，圖1，反應12）。另外，許多新的代謝能力也被發現，比如光氧亞硝酸鹽氧化(phototrophic nitrite oxidation)和生成硝酸鹽的完全氨氧化（complete ammonia oxidation (comammox)）。許多新型的微生物也被鑑定出來，比如氨氧化古生菌(ammonia-oxidizing archaea14)，反硝化真核生物有孔蟲（denitrifying

eukaryotic foraminifera）和共生異養的固氮藍藻(symbiotic heterotrophic

nitrogen-fixing cyanobacteria)。

本文中，我們在這些新發現的背景下，對目前由微生物引起的氮轉化過程進行理解，並對這些微生物構成的氮轉化反應，參與氮轉化的微生物以及它們的生理和環境功能進行描述，也對那些並未發現但可能會發生的反應進行了描述。此外，我們對由氮轉化微生物之間的相互作用而構成的複雜網絡和其對全球生物化學氮循環的影響進行了討論。

Box 1 | 氮全球生化循環圈：全球的氮庫存、氮轉化過程、氮通量

Box 1 | Biogeochemical nitrogen cycling: global inventories, processes and fluxes

圖Box 1. 氮全球生化循環圈：全球的氮庫存、氮轉化過程、氮通量

如圖Box 1所示，圖中灰色方塊表示氮儲存量，束縛在巖石和沉積物中的最大氮存量是氨（1.8×10¹⁰Tg氮），雖然這種束縛氨經侵蝕後可被生物利用，但是它在整個氮循環生化圈中起的作用是很小的，而陸地中可自由獲得的氨的儲存量是未知的，海洋中的氨的氮儲存量被估計為340 ~ 3600 Tg；全球中可自由獲得氮的儲存庫是大氣中的氮氣（約為3.9×10⁹Tg氮）, 緊接著是有機氮、硝酸鹽、氧化亞氮中氮的儲存量；而全球的亞硝酸鹽和一氧化氮中的氮儲存量可以忽略不計。

在這些氮儲存庫中形成的全球生化的氮循環主要是因為以下六個不同的氮轉化過程：同化作用（Assimilation）、氨化作用（ammonification）、硝化作用（nitrification）、反硝化作用（denitrification）、厭氧氨氧化作用(anammox) 和固氮作用（nitrogen fixation）。我們從可查文獻中估計了這些過程中的年度氮通量，並作出了如圖Box 1所示的簡單的假設，在本圖中，我們用每年所含 Tg氮來表示在這些主要含氮的物質之間的氮通量，其中綠色、藍色和紅色方塊分別代表每年的陸地氮通量、每年的海洋氮通量以及每年人為製造的氮通量。其中最明確的氮通量包括氮的流失和固定，因為它們是重點研究的對象。如圖Box 1所示，雖然這些明確的氮通量相對較小，但它卻可以調控這些生物可利用氮的可用性，而這些生物可利用氮在很大程度上可以通過生物碳泵來控制大氣中二氧化碳的去除。據目前估計，生物固氮量（300 Tg氮/年）和人工固氮量（125 Tg/年）的總和已經超過了通過厭氧氨氧化和反硝化作用產生的氮氣的量（350 Tg氮/年）。並不是所有的經一氧化氮還原產生的氧化亞氮都可以進一步的被還原為氮氣，而每年從海洋和陸地環境中釋放的氧化亞氮的氮通量分別為4 Tg和12 Tg，雖然與其他氮形式的通量相比，氧化亞氮的氮通量相對較小，但是它對環境影響卻很大，因為氧化亞氮是破壞臭氧層的主要氣體，而且它還是一個強大的溫室氣體。

如圖Box 1所示，在這些不同的氮轉化過程中有著截然不同的氮通量，它們並沒有達成一個平衡的氮循環，這和論文及教材中經常描述的一樣，而最大的氮通量跟氨氣和有機氮的相互轉化有關。僅在海洋環境中，每年與氨化作用和氨同化作用有關的氮通量（8800 Tg氮/年）比海洋中氮的流失和獲得的氮通量總和（約400 Tg氮/年）高出了一個數量級。另一個巨大的氮通量（約2000 Tg氮/年）跟硝化作用有關，這也正好可以解釋為什麼在海洋中氨鹽的濃度雖然不高，但是海洋氨氧化古生菌卻是最豐富的微生物之一。與硝酸鹽同化有關的氮通量和硝化作用的氮通量是一個數量級的，即海洋浮遊植物每年可減少約2000 Tg的硝酸鹽氮。而與之相比，異化硝酸鹽還原為氨的氮通量可能會比較小。雖然目前還沒有可用的陸地環境氮通量估計的數據，但是陸地植物與海洋植物相比對氮的需求比較低。對於陸地植物來說，平均每固定40個分子的碳才需要1分子的氮，而對於海洋植物來說，平均每固定6.6個分子的碳就需要1分子的氮，所以陸地中與同化作用相關的氮通量大概是海洋中的1/6。所以假設在穩定狀態下（即氮的獲得和流失相等），我們用海洋中的氮通量除以6來估計陸地環境中硝化作用與氨化作用中的氮通量。

圖1 | 微生物轉化氮化合物

圖1. 微生物構成的氮化合物的轉化

如圖1所示微生物攜帶的酶可以執行14個氧化還原反應，在這些氧化還原反應中主要包括8種不同氧化狀態下的無機氮（限制酶的中間產物和它們的氧化還原狀態沒有顯示）。氨氣與有機氮的相互轉化不涉及氮原子氧化還原狀態的改變。其中紅色的表示還原反應，藍色的表示氧化反應，綠色的表示歧化反應(disproportionation)和歸中反應(comproportionation)。接下來是執行各種反應的酶：同化硝酸鹽還原酶（NAS、nasA和nirA）；膜結合酶（NAR, narGH）；周質異化硝酸還原酶（NAP, napA）；亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR, nxrAB）；一氧化氮氧化酶（NOD, hmp）；含血紅素（cd₁-NIR, nirS）和含銅的亞硝酸還原酶（Cu-NIR, nirK）；依賴紅細胞色素（cNOR, cnorB）、依賴對苯二酚（qNOR, norZ）和含銅的依賴對苯二酚一氧化氮還原酶（Cu_ANOR）；依賴NADH細胞色素P₄₅₀的一氧化氮還原酶（P₄₅₀NOR, p450nor）；黃銅-二鐵一氧化氮還原酶（NORvw, norVW）；雜交簇蛋白（HCP, hcp）；羥胺氧化還原酶（HAO, hao）；羥胺氧化酶（HOX, hox）；氧化亞氮還原酶（NOS, nosZ）；一氧化氮歧化酶（NO-D, norZ）；同化亞硝酸鹽還原酶（cNIR, nasB和nirB）；周質異化細胞色素C亞硝酸鹽還原酶（ccNIR, nrfAH）；ε-羥胺氧化還原酶（εHAO, haoA）；八面體血紅素亞硝酸鹽還原酶（ONR）；八面體血紅素連四硫酸鹽還原酶（OTR）；鉬-鐵（MoFe, nifHDK）、鐵-鐵（FeFe, anfHGDK）和釩-鐵（VFe, vnfHGDK）固氮酶；聯氨脫氫酶（HDH, hdh）；聯氨合成酶（HZS, hzsCBA）；氨單加氧酶（AMO, amoCAB）；微粒甲烷單加氧酶（pMMO, pmoCAB）；氰酸酯酶（CYN, cynS）; 尿素酶（URE, ureABC）。

Fig. 1 | Microbial transformations of nitrogen compounds. Microorganisms carry enzymes that perform 14 redox reactions involving 8 key inorganic nitrogen species of different oxidation states (enzyme-bound intermediates and their redox states are not shown). The interconversion of ammonia and organic nitrogen does not involve a change in the redox state of the nitrogen atom. The reactions involve reduction (red), oxidation (blue) and disproportionation and comproportionation (green). The following enzymes perform the nitrogen transformations: assimilatory nitrate reductase (NAS, nasA and nirA); membrane-bound (NAR, narGH) and periplasmic (NAP, napA) dissimilatory nitrate reductases; nitrite oxidoreductase (NXR, nxrAB); nitric oxide oxidase (NOD, hmp); haem-containing (cd₁‑NIR, nirS) and copper-containing (Cu‑NIR, nirK) nitrite reductases; cytochrome c‑dependent (cNOR, cnorB), quinol-dependent (qNOR, norZ) and copper-containing quinol-dependent nitric oxide reductases (Cu_ANOR); NADH-dependent cytochrome P₄₅₀nitric oxide reductase (P₄₅₀NOR, p450nor); flavo-diiron nitric oxide reductase (NORvw, norVW); hybrid cluster protein (HCP, hcp); hydroxylamine oxidoreductase (HAO, hao); hydroxylamine oxidase (HOX; hox); nitrous oxide reductase (NOS, nosZ); nitric oxide dismutase (NO‑D, norZ); assimilatory nitrite reductase (cNIR; nasB and nirB); dissimilatory periplasmic cytochrome c nitrite reductase (ccNIR, nrfAH); ε-hydroxylamine oxidoreductase (εHAO; haoA); octahaem nitrite reductase (ONR); octahaem tetrathionate reductase (OTR); molybdenum-iron (MoFe, nifHDK), iron-iron (FeFe, anfHGDK) and vanadium-iron (VFe, vnfHGDK) nitrogenases; hydrazine dehydrogenase (HDH, hdh); hydrazine synthase (HZS, hzsCBA); ammonia monooxygenase (AMO, amoCAB); particulate methane monooxygenase (pMMO, pmoCAB); cyanase (CYN, cynS); and urease (URE, ureABC).

圖2 | 催化氮循環中關鍵的四種反應的酶

圖2 | 催化四個關鍵氮循環反應的酶。

a | 鉬鐵（molybdenum-iron，MoFe）固氮酶包含電子轉移蛋白（綠色；由nifH編碼）和催化酶的α亞單位（洋紅；由nifD編碼）和β亞單位（紫色；由nifK編碼）。nifH用於檢測環境中的固氮微生物。鐵硫簇介導電子轉移到催化中心。電子轉移和催化蛋白的結合和解離需要輸入ATP。

b | 在厭氧氨氧化細菌庫尼尼亞-斯圖加滕斯中，電子流過八胺羥胺氧化酶（紅色箭頭）。屬於不同單體的血紅素用綠色、藍色和灰色表示。Haem 4是催化中心。

c | 在膜結合細菌硝酸還原酶（NAR）中，催化二聚體由narG和narH編碼，而膜錨由narI編碼。narG用於檢測環境中的反硝化微生物。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽發生在細胞質，質子轉移到周質體。因此，NAR對質子動力有貢獻。

d | 在斯圖加滕氏桿菌中，hzsA、hzsB和hzsC編碼聯氨合酶。hzsA、hzsB用於環境中厭氧氨氧化菌的檢測。這種酶被認為進行兩步反應。開始於γ亞單位（灰色），一氧化氮還原為羥胺，通過底物通道（棕色）轉運至α亞單位（綠色）。α亞單位將羥胺與氨水化合為聯氨。這兩種反應都是由細胞色素c型血紅素蛋白催化的。

*氟化ADP-銨；ATP類似物。a部分經david goodsell，doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2002_2（2002年2月）許可改編。b部分最初Maalcke，W.J.等人發表在《生物化學雜誌》上八亞甲基氧化還原酶產生生物一氧化氮的結構基礎。2014年；289:1228-1242。（參考文獻8）。c部分經Elsevier參考文件154的許可進行了修改。d部分經麥克米倫出版有限公司參考文件115的許可進行改編。

Fig. 2 | Enzymes catalysing four key nitrogen-cycling reactions.

a | The molybdenum-iron (MoFe) nitrogenase enzyme contains the electron transfer protein (green; encoded by nifH) and the α-subunit (magenta; encoded by nifD) and β-subunit (purple; encoded by nifK) of the catalytic enzyme. nifH is used to detect nitrogen-fixing microorganisms in the environment. The iron-sulfur clusters mediate electron transfer to the catalytic centre. The association and dissociation of the electron transfer and catalytic proteins require the input of ATP.

b | In the anaerobic ammonium-oxidizing bacterium Kuenenia stuttgartiensis, electrons flow through the haems of the octahaem hydroxylamine oxidase (red arrows). Haems belonging to different monomers are depicted in green, blue and grey. Haem 4 is the catalytic centre.

c | In the membrane-bound bacterial nitrate reductase (NAR), the catalytic dimer is encoded by narG and narH, whereas the membrane anchor is encoded by narI. narG is used to detect denitrifying microorganisms in the environment. Nitrate reduction to nitrite occurs in the cytoplasm, and protons are translocated into the periplasm. Thereby, NAR contributes to the proton motive force.

d | In K. stuttgartiensis, hzsA, hzsB and hzsC encode hydrazine synthase. The former two genes are used to detect anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in the environment. This enzyme is proposed to perform a two-step reaction. It starts in the γ-subunit (grey) with the reduction of nitric oxide to hydroxylamine, which is transported through the substrate channel (brown) to the α-subunit (green). The α-subunit comproportionates hydroxylamine with ammonia into hydrazine. Both reactions are catalysed by cytochrome c‑type haem proteins.

*ADP-ammonium fluoride; ATP analogue. Part a is adapted with permission from David Goodsell, doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2002_2 (February 2002). Part b was originally published in the J. Biol Chem. Maalcke, W. J. et al. Structural basis of biological NO generation by octaheme oxidoreductases. 2014; 289: 1228–1242. © the American Society for Biochemistry and Molecular Biology (REF. 8). Part c is adapted with permission from REF. 154, Elsevier. Part d is adapted with permission from REF. 115, Macmillan Publishers Limited.

氮轉化反應

Nitrogen-transforming reactions

固氮作用

Nitrogen fixation

大氣中的氮氣是可以自由獲得氮的最大庫存，但從生物學上講，只有微生物攜帶的金屬固氮酶可以將氮氣固定為氨(ammonia)。固氮酶普遍分布在細菌和古生菌中，這使它們在生物可利用氮被消耗的環境中存在非常有利的競爭優勢。總共有三種類型的固氮酶：鐵-鐵（FeFe）、釩-鐵（VFe）和鉬-鐵（MoFe）固氮酶，它們有相似的序列、結構和功能特性，但它們的金屬輔因子（cofactor）不同，而所有的固氮酶都是有兩種物質組成（圖2a）。anfDGK，vnfDGK或nifDK分別在活動中心分別編碼含鐵、釩或鉬的固氮酶的催化成分。此外，anfH、vnfH 或 nifH 編碼含鐵的電子轉運蛋白（又稱固氮還原酶nitrogenase reductase或鐵蛋白iron protein）。NifH是用來檢測環境中有固氮作用微生物的標記基因。土壤細菌Azotobacter vinelandii可以編碼全部三種類型的固氮菌，然而其它微生物，比如海洋固氮菌Trichodesmiumspp. 只含有鉬鐵固氮酶。釩是很少被限制，但鉬和鐵分別在陸地和海洋環境中是罕見的，因此鉬和鐵可以分別在相應的生態系統中限制固氮作用。

在固氮作用中，一個電子載體比如鐵氧化還原蛋白會首先會還原鐵蛋白，隨後會還原催化劑組分，這需要鐵和催化蛋白的分離和再結合。每固定一分子的氮分子，需要消耗16分子的ATP。額外的生物能量損耗是由於強大的還原劑如鐵氧化還原酶的生產和不穩定含氧固氮酶的保護。由於氧氣的暴露會使固氮酶失效，故含氧的光能利用菌，比如Trichodesmiumspp.、Crocosphaera watsonii和Nodulariaspp. 會使固氮作用和光合作用從空間上（如專門的固氮異形細胞裡）或時間上分離。而非光和作用的生物體生活在含氧環境中則需要一些機制從氧氣中保護它們的固氮酶，比如增加氧氣呼吸、超氧化物歧化酶的解毒作用和固氮酶的構象等機制。而關於存在能夠用一個不尋常的固氮酶去進行一個完全不同的、對氧氣不敏感的固氮途徑的觀點也在最近被反駁了。

雖然固氮作用的真核生物還沒有被發現，但許多有固氮作用的微生物都可以和真核生物共生。例如單核藍藻菌UCYN-A是固氮微生物中最普遍的一種，它與小型的單核海藻共生，並在海洋固氮作用中起著重要的作用。共生固氮微生物也是動物腸道菌群的一部分，比如在白蟻類和雙殼類中發現的一些特殊細菌。此外，根瘤菌目的一些固氮成員生活在豆科農作物的根瘤中，像苜蓿、黃豆、豌豆和大豆等植物，這些農作物提供了全球20%的食物蛋白。

氨氧化成羥胺

Ammonia oxidation to hydroxylamine

所有已知的好氧氨氧化細菌和古菌都通過使用氨單加氧酶（ammonia monooxygenase, AMO）將氨氧化成羥胺而激活氨。大多數氨氧化細菌屬於Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria類，並且是屬於氨氧化成亞硝酸鹽的化學自養生物。它們幾乎可以在所有環境中找到，包括施肥土壤和汙水處理廠。屬於奇古菌門(Thaumarchaeota)的古菌，例如泉古菌（Nitrosopumilus maritimus），也可以通過將氨氧化成亞硝酸鹽來進行化學自養的生長。他們的發現解決了海洋中似乎罕見的氨氧化劑的長期謎團。在一些沙質和粉質粘土中奇古菌門比細菌更豐富。此外，嗜酸性氨氧化古菌』CandidatusNitrosotalea devanaterra』的分離推翻了由於氨的可用性低導致化學自養型氨氧化不能在低pH下發生的普遍假設。許多氨氧化劑，如Nitrosospirasp.和Nitrososphaera viennensis也可以降解有機氮化合物，例如，通過用尿素酶水解尿素以產生額外的氨。古細菌Nitrososphaera gargensis也可以通過用氰化酶水解氰酸鹽來產生氨。

最近，在Nitrospira屬的成員中也發現了氧化氨的能力，以前認為它只能夠進行亞硝酸鹽氧化。發現這些將氨氧化成硝酸鹽的細菌（完全氨氧化comammox），駁斥了氨和亞硝酸鹽氧化需要兩組不同微生物的教條。執行完全氨氧化過程的細菌，例如』CandidatusNitrospira inopinata』似乎很好地適應氨限制環境，並且在氨利用上可以勝過大多數可培養的氨氧化微生物。在氨上生長的完全氨氧化培養物中亞硝酸鹽的瞬時積累表明它們比亞硝酸鹽更有效地氧化氨。我們假設進行完全氨氧化過程的細菌在氨限制條件下將氨氧化成硝酸鹽，並在氧限制條件下進行部分氨氧化成亞硝酸鹽。

AMO與甲烷單加氧酶（MMO）密切相關，甲基單加氧酶存在於甲烷氧化菌如γ-變形菌門和候選門NC10（參考文獻9）中。儘管效率非常低，MMO也可以將氨氧化成羥胺（圖1）。同樣，AMO也可以氧化甲烷，但效率低於MMO。有趣的是， （如在地下水中）檢測到amo細菌序列執行完全氨氧化過程，但是被錯誤地指定為絲狀甲烷氧化菌Crenothrix polyspora的MMO（pmo）基因微粒。最近對C.polyspora和其他Crenothrix物種的重新測序表明它們實際上含有典型的γ-蛋白質細菌pmo而不是amo。

羥胺氧化成一氧化氮和亞硝酸鹽

Hydroxylamine oxidation to nitric oxide and further to nitrite

氨氣向羥胺的有氧氧化是一個吸熱反應，因此，所有的氨氧化劑可以使羥胺氧化從而保存能量。而需氧氨氧化細菌用八面體血紅素羥胺氧化還原酶（HAO）可以將羥胺氧化成亞硝酸鹽。但最近研究表明，HAO將羥胺氧化的結果不是亞硝酸鹽，而是一氧化氮，然後一氧化氮在一種未知的酶作用下才會被進一步氧化成亞硝酸鹽。儘管目前這種未知的催化酶還沒有被最終確定下來，但是含銅的亞硝酸還原酶（Cu-NIR,nirk）卻可以在一氧化氮被氧化成亞硝酸鹽的相反方向起到催化作用。所有的氨氧化細菌，包括新發現的可以一步使氨氣徹底氧化成硝酸鹽的硝化螺菌屬細菌(Nitrospiraspp.)，它們都包含氨單加氧酶（AMO）和羥胺還原酶（HAO）。相比之下，已知的氨氧化古生菌卻不能編碼羥胺還原酶（HAO），而使羥胺氧化反應發生的古生菌酶還是未知的。

羥胺氧化還原酶（HAO）屬於八面體血紅素(octahaem)蛋白家族，在很多微生物中都已經被發現（圖2b）。厭氧氨氧化細菌的基因可以編碼約十種的類似於HAO的蛋白，而其中的一種也可以使羥胺氧化成一氧化氮。在厭氧氨氧化細菌中，這種羥胺氧化酶（HOX）可以回收從聯氨合成酶(HZS)中洩漏的羥胺。

甲烷氧化細菌也可以產生羥胺，這是由於它們非特異的氨氧化反應。屬於變形菌門、疣微菌門和NC10菌門中的多種多樣的甲烷氧化菌可以編碼類似HAO的蛋白，而這種蛋白很有可能使羥胺氧化成一氧化氮，一氧化氮還可以進一步被氧化成亞硝酸鹽或者被還原成氧化亞氮( 一氧化二氮/笑氣)。目前，在甲烷氧化細菌中發生的這種反應是否可以直接有助於能量保存還未知。

亞硝酸鹽向硝酸鹽的氧化

Nitrite oxidation to nitrate

亞硝酸鹽的氧化是產生硝酸鹽的主要生化途徑，而這一過程可以通過亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）來完成。NXR可以被需氧的亞硝酸鹽氧化細菌（包括Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Chloroflexi, Nitrospinae和 Nitrospirae）、不產氧的光能利用菌（比如莢硫菌屬Thiocapsa的KS1、紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas的LQ17）、厭氧氨氧化細菌編碼。而需氧的亞硝酸鹽細菌在亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）的作用下會直接發生亞硝酸鹽氧化反應從而來保存能量，但是厭氧亞硝酸細菌卻不能做到。此外，厭氧氨氧化細菌會將厭氧亞硝酸氧化反應和碳固定作用結合起來。

亞硝酸氧化細菌具有豐富多樣的代謝功能，而且還可以在不是亞硝酸鹽的基質上生長。的確，硝化螺菌屬的一些細菌可以將氨氣徹底氧化成硝酸鹽，當硝化螺菌屬以硝酸鹽為基質進行呼吸作用時，在含氫氣環境中生長會進行有氧呼吸，而在有機酸環境中生長則進行厭氧呼吸。亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）跟細菌和古生菌的硝酸鹽還原酶也相關，亞硝酸鹽氧化細菌在NXR的催化作用下進行硝酸鹽還原反應。

亞硝酸鹽和氨氧化微生物在農業土壤中可以協同作用將氨基化肥轉變成硝酸鹽，它們在肥料向河水和地下水中的流失過程中起著關鍵的作用，而化肥的流失會導致河流、湖泊、海岸水域的水體富營養化。與上述同樣的協同作用在汙水處理工廠中也會被用做去除氮的第一步處理(BOX 2)。在海洋環境中，亞硝酸鹽氧化細菌會生產硝酸鹽，而硝酸鹽是海洋中最主要的生物可利用氮，同時亞硝酸鹽氧化細菌也有助於碳的固定。

硝酸鹽還原為亞硝酸鹽

Nitrate reduction to nitrite

硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽是用來進行呼吸作用的（異化硝酸鹽還原反應/dissimilatory nitrate reduction），同時也使氮被同化成生物量。硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽的反應都可以由來自三個領域中的微生物來完成，而這些微生物都存在於含有硝酸鹽的缺氧環境中，包括土壤、低氧區、海洋沉積物和人類胃腸道中。這些反應可以被膜結合硝酸還原酶（NAR）或者周質的硝酸還原酶（NAP）催化，而且許多生物體，包括副球菌屬的反硝化細菌都含有NAR和NAP。NAR在細胞質中還原硝酸鹽，並將質子釋放到細胞質中（圖3c），並通過質子的動能量直接有助於節約能量。相比之下，NAP在細胞外周質中將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此不改變質子位置。

異化的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽不僅僅是反硝化作用的第一步。許多微生物，比如廣泛分布在淡水和海洋沉積物中的巨大硫氧化貝日阿託氏菌就是先將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，再進一步還原為氨鹽。還有許多微生物，比如海洋進化分支SAR11的一些成員只把硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。硝酸鹽的還原對於其它氮循環過程來說是亞硝酸鹽的一個主要的來源，比如需氧的亞硝酸鹽氧化和厭氧氨氧化作用。異化的硝酸鹽還原反應還可以與有機物、甲烷、硫化物、氫氣或者鐵等電子供體的氧化作用相結合。

==硝酸鹽是真核生物的主要氮源==，而細菌和古生菌中都含有同化硝酸鹽還原酶（NAS）。考慮到硝酸鹽支持了至少20%的海洋藻類的生長，所以在海洋中，硝酸鹽的同化吸收作用很可能已經超過了氮循環過程中其它大部分的氧化還原反應(BOX 1)。NAS與同化亞硝酸鹽還原酶共同產生了氨氣，而這氨氣也成為了生物量的一部分。因為NAS定位於細胞質中，所以硝酸鹽的同化需要用依賴ATP的轉運蛋白將硝酸鹽轉運到細胞內。由於這種能量的需求，NAS的活性會在充滿氨的環境中被抑制（比如肥沃的土壤中）。

細菌和古生菌的NAS、周質的硝酸還原酶（NAP）、膜結合硝酸還原酶（NAR）和亞硝酸鹽氧化還原酶（NXR）都屬於二甲亞碸還原酶家族，而真核生物的同化硝酸鹽還原酶屬於亞硫酸鹽氧化酶家族，這就表明硝酸鹽還原酶有多種起源。同化硝酸鹽反應與異化硝酸鹽還原反應的途徑間的差別並不是絕對的，從原理上講，亞硝酸鹽的產生是由於在呼吸鏈上可以進一步減少硝酸鹽的還原反應。相反的是，結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)已被證實可以用NAS複合體來進行硝酸鹽的同化吸收。

亞硝酸鹽還原為銨鹽

Nitrite reduction to ammonium

亞硝酸鹽還原為氨鹽的反應可以用做同化作用，也可以用作異化作用。異化亞硝酸鹽反應大部分是由嗜熱的熱球菌屬（thermophilic Pyrolobus fumarii）家族的細菌來完成的，它們屬於Crenarcheota門的甲烷氧化古菌。這種反應是由nrfAH編碼的周質的細胞色素c亞硝酸鹽還原酶（ccNIR）、八面體血紅素亞硝酸鹽還原酶（ONR）或者八面體血紅素連四硫酸鹽還原酶（OTR）催化完成。目前尚不清楚後兩種酶是否能用於呼吸作用、亞硝酸鹽或羥胺的解毒作用中。亞硝酸鹽還原為銨鹽的過程中還涉及到中間產物羥胺的形成，而羥胺一直和相應的酶結合在一起直到轉變成銨鹽。

有趣的是，厭氧氨氧化細菌K. stuttgartiensis在缺少產生銨鹽的亞硝酸鹽還原酶的情況下，還可以將亞硝酸鹽還原為銨鹽，因此可以推測亞硝酸鹽還原為銨鹽是由一種類HAO的蛋白完成的。最近研究表明，一種羥胺還原酶（HAO）可以被ε-變形菌門（比如胎兒彎曲桿菌Campylobacter fetus和鸚鵡螺菌Nautilia profundicola）編碼，此酶被稱為εHAO，也可以將亞硝酸鹽或羥胺還原為銨鹽，只不過效率比較低。

異化的亞硝酸鹽還原為銨鹽的反應是異化硝酸鹽還原為銨鹽（DNRA）過程的關鍵反應。微生物可以利用異化硝酸鹽還原為銨鹽反應（DNRA）和電子供體的氧化耦合來生長，比如有機物、二價鐵、氫氣、硫化物、甲烷等電子供體。但DNRA對環境的重要性還未可知，而且在海洋和湖泊等沉積物中當與硝酸鹽有關的電子供體超量時，DNRA反應就更喜歡反硝化作用。

同化亞硝酸鹽還原酶可以產生氨，而且它和NAS一樣普遍，這兩種酶經常被相同的nas操縱子編碼。在海洋中亞硝酸鹽最大值的形成是由於浮遊植物中硝酸鹽的同化吸收作用與亞硝酸鹽的還原作用並沒有偶聯，從而可以釋放更多的亞硝酸鹽，但這種未偶聯的生理原因並不清楚。

亞硝酸鹽還原為一氧化氮

Nitrite reduction to nitric oxide

許多微生物都有將亞硝酸鹽還原為一氧化氮的能力，比如變形菌、厭氧氨氧化菌和擬桿菌。這些微生物在很多環境中都能被發現，比如在土壤、低氧區、海洋沉積物等環境中（在這些環境中硝酸鹽可被利用且含氧量低）。這種反應可以由兩種不相關的酶催化，包含血紅素的cd₁亞硝酸鹽還原酶(cd₁-NIR; 被nirS編碼)和含銅的亞硝酸鹽還原酶(Cu-NIR; 被nirK編碼)，而且這兩種酶在細菌和古生菌中都普遍分布。這兩種酶都存在於外周質細胞內，不會直接有助於節約能量。這兩種酶也可以一起出現在同一個微生物內，比如海洋紅嗜熱鹽菌(Rhodothermus marinus)。

==通常nirS 和nirK 被用作基因標記來研究環境中的反硝化菌==，而且這些基因在其他很多微生物中都存在，包括厭氧氨氧化細菌、亞硝化細菌、甲烷氧化細菌、氨氧化細菌和古生菌。除了cd₁-NIR和Cu-NIR，其他亞硝酸鹽還原酶也可能存在。比如，一些厭氧氨氧化細菌並不包含nirS 和nirK 這兩種基因，但卻可以將亞硝酸鹽還原為一氧化氮。而為了執行這種反應，這些細菌可以利用類似於HAO的八面體血紅素氧化還原酶。

一氧化氮還原為氧化亞氮或氮氣

Nitric oxide reduction to nitrous oxide or dinitrogen gas

一氧化氮是一種信號分子，一種有毒物質，也是反硝化作用、硝化作用和厭氧氨氧化作用過程中的一個中間產物。此外，可催化需氧的反硝化作用的細菌可以將2分子的NO變成1分子的N₂和1分子的O₂。此後，能夠使NO還原的微生物在環境中被廣泛發現，包括廢水處理工廠、農業土壤、海洋沉積物、海洋低氧區。由微生物引起的NO還原反應是N₂O的主要來源，而N₂O是一個強大的溫室氣體（比CO₂的溫室效應強烈310倍，也是破壞臭氧層的主要物質。能夠產生N₂O的一氧化氮還原酶（NOR）被用於一氧化氮的解毒作用或呼吸作用。屬於不同組的酶從黃素蛋白到血紅素銅氧化酶，它們都通過生命樹而廣泛分布。黃銅-二鐵蛋白例如黃銅-二鐵一氧化氮還原酶（NORvw）可以通過像硫酸鹽還原細菌Desulfovibrio

gigas來解毒一氧化氮。其他的NOR類型的酶是從真菌線粒體中發現的依賴NADH細胞色素P₄₅₀的一氧化氮還原酶，如鐮刀菌屬的馬拉色菌Fusarium oxysporum以及最近在大腸桿菌Escherichia coli中發現的混合聚類蛋白(hybrid cluster protein, HCP)。

血紅素銅氧化酶家族包括末端氧化酶類，比如依賴紅細胞色素cNOR、依賴對苯二酚qNOR和含銅的依賴對苯二酚Cu_ANOR，它們都在利用NO呼吸中起作用。氧化亞氮是反硝化作用的中間產物，而NOR存在於反硝化細菌P. denitrificans和假單胞菌屬Pseudomonas stutzeri等微生物中。氧化亞氮對於一些微生物來說也可以是最終產物，比如綠葉假單胞菌Pseudomonas chlororaphis。氨氧化細菌在硝化-反硝化作用中可以產生氧化亞氮，NOR是被用來在亞硝酸鹽還原過程中還原產生的NO的。在氨氧化細菌和能夠一步徹底氧化氨到硝酸鹽的可用細菌中，氧化亞氮也可以通過細胞外的中間產物一氧化氮和羥胺的非生物反應產生。此外，氨氧化細菌還可以在羥胺氧化中產生的一氧化氮還原酶（NOR）的催化作用下產生氧化亞氮。和氨氧化細菌相似，嗜甲烷細菌也可以通過在羥胺氧化和亞硝酸鹽還原中NOR的催化作用產生氧化亞氮。與此相比，氨氧化古生菌只是通過中間產物NO和羥胺的非生物反應產生氧化亞氮。

氮肥的使用大幅度增加了氧化亞氮的排放。由於氮轉化微生物的協同作用，3%-5%的氮作為農業氮肥被轉化成氧化亞氮。氮肥越來越多的被用來種植農作物，用於生物燃料生產，這為代替化石燃料提供了可能。但也因此形成了一個困境，越多的氮肥被用來生產生物燃料，就會有越多的氧化亞氮被排放出來。為了生產生物燃料而對氮肥的使用，抵消了由於減少對化石燃料的使用降低的溫室效應的效果。

NO轉變成氮氣和氧氣的歧化作用是最近被發現的新的氮轉化反應（圖1）。從湖泊和溼地等富含甲烷和硝酸鹽的缺氧系統中發現的微生物（比如』Ca.Methylomirabilis oxyfera』）用這種歧化反應從亞硝酸鹽中產生自己的氧氣。』Ca.Methylomirabilis oxyfera』可以在缺氧環境中生存，也可以利用需氧的甲烷氧化途徑。這種歧化反應包含一種不尋常的酶qNOR，暫時稱這種酶為一氧化氮歧化酶（NO-D）。一氧化氮的歧化反應比之前預想的更為普遍，與此相似的是，這種不尋常的酶qNOR的基因序列在其它菌門中也存在，比如γ-變形菌門的HdN1菌株和擬桿菌門的Muricauda ruestringensis。

氧化亞氮還原為氮氣

Nitrous oxide reduction to nitrogen gas

由微生物引起的氧化亞氮向氮氣的還原，是減少這種強大溫室氣體的主要途徑。已知的催化這種反應的酶只有氧化亞氮還原酶（nitrous oxidereductase, NOS），而這種酶定位於細胞外周質中，這對於由質子動能引起的能量節約並沒有直接的促進作用。來自於變形菌門、擬桿菌們、綠菌門的多種多樣的細菌與來自於泉古菌門、嗜鹽菌門的古生菌都能使用NOS。在大腸桿菌中發現的稍微不同的能夠編碼NOS的基因揭示了人們忽視了土壤中NOS基因序列的多樣性。編碼NOS變體的生物經常不含有其它NO還原酶。一些真核生物，比如有孔蟲類Foraminifera和網足蟲Gromiida,目也可以減少氧化亞氮，但是它們的酶學機制未知。

長久以來，人們都認為NOS比其他氮化合物還原酶對氧氣、pH、硫化物更敏感。基於這種明顯的敏感性，氧化亞氮向環境中的排放完全歸因於在能夠使硝酸鹽被還原為氮氣的完全反硝化菌生物體內NOS的活性被抑制。此外，比如土壤和海洋環境，由於這些不完全反硝化菌的相作，比只能進行亞硝酸鹽還原為氧化亞氮反應或者化亞氮還原為氮氣的反應的微生物生態位的差別也會導致氧化亞氮的產生和消耗間的不平衡。

聯氨合成和氧化為氮氣

Hydrazine synthesis and hydrazine oxidation to dinitrogen gas

人們普遍認為只有氧氣才能激活氨氣，而生物可利用氮的損失只有通過反硝化作用被轉化為氮氣。然而最近以亞硝酸鹽作為終端電子受體轉化成氮氣的厭氧氨氧化反應卻推翻了這兩種教條觀點。HZS是唯一已知的可以激活厭氧氨的酶，而且它只在浮黴菌門中的五種厭氧氨氧化細菌中被發現。HZS也是唯一已知的可以使兩種離散的氮化合物形成N-N化合鍵的酶，在一個含有兩步的反應中會產生中間產物聯氨。而聯氨合成的假設機制是從一氧化氮還原為羥胺開始的(圖2d)，然後羥胺和氨一起發生歸中反應產生聯氨，而聯氨在自然界中是最強有力的還原劑之一。在這種反應中，羥胺從一個活動位點轉移到另一個活動位點(圖2d)，這樣在聯氨合成酶HZS的作用下消耗羥胺。編碼HZS的基因有兩個，分別是hzsA和hzsB，這兩種基因一般會被作為環境中厭氧氨氧化細菌的標記基因。

聯氨脫氫酶（hydrazine dehydrogenase, HDH）可以將聯氨氧化成氮氣。通過對胺基酸的測序，知道了這種酶與羥胺氧化還原酶（HAO）和羥胺氧化酶（HOX）有關，但被羥胺抑制且只氧化聯氨。聯氨的氧化作用發生在被稱為厭氧氨氧化體的一種獨特的膜結構中，而且很可能與節省能量有直接關係。有趣的是，厭氧氨氧化細菌的所有分解代謝酶（HDH, HZS, NIR, HOX 和 NXR）都只存在於厭氧氨氧化體中。

HDH主要負責向大氣中釋放氮氣。在上一個10年，關於在海洋中的厭氧氨氧化過程已經很清楚了，而且該過程在陸地生態系統中也有著非常重要的作用。

Box 2 | 利用微生物去除廢水的氮

Box 2 | Nitrogen removal by microorganisms in wastewater treatment

自工業革命以來，農耕、化石燃料的燃燒、家庭和工業產生的廢水等一直都是造成氮汙染的主要因素，而氮汙染嚴重影響著地球上的生命。在過去的四十年，當發現過量的氮會導致水體富營養化以及氨鹽的毒性可以造成魚類的死亡時，氮就被認為是廢水中重要的汙染物，因此，在原本用來去除有機碳的廢水處理工廠裡都又添加了氮去除系統，然而大部分常規的廢水處理工廠並沒有進行對氮的去除。

在大多數自然生態系統中，珍貴的氮都是是被循環回收和保存的，但與此對比，在廢水處理廠卻需要通過特殊設計將水體中的銨鹽轉變成氮氣釋放到大氣中。在廢水處理廠中，有機碳會首先被去除，然後將有機碳貧乏但銨鹽氮豐富的水體送入到氮去除系統中。傳統的去氮系統是依靠硝化作用（NH₄⁺→ NO₂^-→ NO₃^-）將氨鹽氧化成硝酸鹽，再依靠反硝化作用（NO₃^-→ NO₂^-→ NO → N₂O → N₂）將硝酸鹽還原為氮氣。但硝化作用需要大量曝氣增加氧氣來創造條件使氨鹽氧化成硝酸鹽（平均每1分子的氨需要2分子的O₂），然後通過外源添加有機碳（一般為甲醇）誘導將硝酸鹽還原為氮氣的反硝化作用。因此傳統的去氮方法很費財力、精力和資源，而且這個過程中還會產生溫室氣體N₂O。為了緩和這個問題，現在很多不同結構的反應器應運而生，如將富含有機碳的部分原始廢水直接輸入到反硝化作用的步驟中，或者對單獨的一個池子裡進行間接性的曝氣，以促進硝化作用和反硝化作用的進行。

在過去數十年裡，厭氧氨氧化的出現，被用作去除氮的可供選擇的一種方法。在一些簡潔的生物反應器中，需氧的氨氧化細菌（如亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas europea）在氧氣限制條件下可以將一半的生物可利用氨轉化為亞硝酸鹽，稱為部分亞硝化。接下來在細菌『Candidatus Kuenenia stuttgartiensis』作用下發生厭氧氨氧化，將亞硝酸鹽和剩下的氨鹽轉變成氮氣（圖BOX 2中實線所示）。在這種部分亞硝化厭氧氨氧化的系統中，可以生成硝酸鹽的需氧亞硝酸鹽氧化劑（比如硝化螺菌屬Nitrospiraspp. 或者硝化桿菌屬Nitrobacterspp.）是不受歡迎的，因為它們降低了氮去除的效率。這種亞硝化厭氧氨氧化生物反應器與傳統的氮去除系統相比，需要的曝氣較少，而且不需要再另添加有機碳，產生的N₂O氣體也較少。目前，這種亞硝化厭氧氨氧化生物反應器在汙水處理（比如來自厭氧汙泥硝化器的廢水）中也越來越多的被應用，而這些系統在含有較低銨鹽濃度的全市規模的廢水處理中的應用，為可持續的治理廢水鋪平了道路。

最近發現的一些氮循環中的微生物也可以應用到廢水治理中。可以使氨氧化到亞硝酸鹽的古生菌和徹底氨氧化為硝酸鹽的細菌在廢水處理工廠中被發現，但它們在這些系統中所扮演的角色還很不清楚。在氧氣受限制的氮去除系統中（比如亞硝化厭氧氨氧化反應器），那些可以進行徹底的氨氧化成硝酸鹽的細菌可能跟傳統的氨氧化過程一樣產生亞硝酸鹽。而令人興奮的是，新發現的依賴亞硝酸鹽和依賴硝酸鹽的厭氧甲烷氧化微生物為廢水的治理提供了一種新的可能。一個聯合厭氧甲烷氧化菌（比如『CandidatusMethylomirabilis』

spp.和『CandidatusMethanoperedens』 spp.）聯和可進行厭氧氨氧化反應的微生物反應器，就可以同時去除氨鹽、硝酸鹽和甲烷（圖BOX 2中虛線所示）。這樣的系統已經在實驗室的條件下建立起來了，但這種完整規模的汙水處理系統還沒有在實際環境中被應用，而在這樣系統中，需氧的甲烷氧化劑如Methylomonasspp.可以有助於甲烷的去除。

對氮循環微生物的基本生理和生化以及應的研究正在步步進行中，新的微生物的發現會引領更高效和持續發展的去氮系統，反之亦然。很明顯地，這種趨勢可以保護環境而造福我們的子孫後代。

Box 2 | 利用微生物去除廢水的氮

微生物構成的氮轉化網絡

微生物在氮轉化方面的多樣性是驚人的，每一種微生物都有各自最優的生長條件。由於在自然界中生長環境是多變的，而且很少能達到最優條件，所以微生物個體對氮的轉化效率必然是低效的。然而，在自然界中依靠微生物群落的氮轉化效率比依靠單個微生物的轉化效率高多了。因此，在微生物群的作用下，幾乎沒有生物可利用氮逃逸到大氣中，而以氮氣的形式損失的少量的氮也會由於固氮作用而達到平衡。這種明顯的氮體內平衡不僅是全球生物圈的特徵，也是很多生態系統的特徵，比如森林土壤和海洋環流。這些能夠高效進行氮回收的必需微生物群落，即使因為環境擾動而使微生物的物種組成發生了改變，它們仍然會保持氮轉化的反應。由微生物連接起來的氮轉化過程在自然和人為建造的生態系統中都形成了一個複雜的網絡（圖3）。

世界上最大的生態系統-海洋環流，因為大量的氮回收利用而達到了一個氮平衡（圖3a）。在這裡主要的氮轉化過程是由藍藻細菌如Prochlorococcus marinus完成氮的同化作用、由浮遊動物和異養細菌如『CandidatusPelagibacter ubique』完成的氨化作用和由Nitrosopumilusspp. 和Nitrospinaspp. 完成的硝化作用（BOX 1，圖3a）。而由微生物如Trichodesmiumspp.和『Ca.Atelocyanobacterium』完成的固氮作用，它們在海洋環流中屬於相當小的氮轉化過程。但因為可發生固氮作用的區域非常大，所以它是向海洋中提供生物可利用氮的主要途徑。

與海洋環流相比，那些低氧區的水域雖然不到公海海域的1%，但卻佔海洋領域氮損失的30%-50%(BOX 1)。在這裡，厭氧微生物如『CandidatusScalindua』 spp.可以與需氧的生物體如Nitrosopumilusspp. 和Nitrospinaspp. 共生。由微生物構成的氮轉化網絡在公海的低氧區是非常複雜的，彼此之間以及與旁邊發生的氮轉化過程都是已知的（圖3b）。

和低氧區水域相似，在廢水處理工廠也是以不平衡的氮轉化為特點。這些人為設計的系統主要用來將銨鹽轉變成氮氣排到空氣中的（BOX 2）。

農業土壤是人為建造的最大的生態系統，它們由微生物構成的氮轉化系統已經受到了人工輸入氮的強烈影響。種植的豆科農作物和固氮微生物群形成了共生關係，這大大增加了環境中氮的輸入量。固氮微生物菌如Bradyrhizobiumspp.）經常生活在特定的根瘤中，並給豆科植物提供銨鹽（圖3c），而銨鹽洩漏到周圍土壤中又可以促進其他微生物的氮轉化過程，比如需氧的氨氧化作用。在稻田領域，人工肥料的使用導致了強烈的硝化作用，並加大了氮的損失。最近的研究展示 高度複雜的氮轉化網絡，包括亞硝酸鹽還原『Ca.Methylomirabilis』 spp.和硝酸鹽還原(『Ca.

Methanoperedens』 spp.)甲烷氧化菌 (圖3d)。

在這些生態系統中，一些氮轉化微生物，如厭氧氨氧化菌，可以進行多重氧化還原反應（反應1、2、5、7、10、12和13；圖1）。但是，硝化和反硝化等過程是由一個複雜的特異網絡以模塊化的方式執行的（圖3）。這種模塊化是氮轉化微生物網絡的一個普遍特徵，導致了合作和競爭的相互作用（如圖3所示）。亞硝基槐屬Nitrosopumilusspp.和硝化菌屬Nitrospinaspp.之間存在協同作用，它們共同將氨氧化成硝酸鹽（圖3a，b）。在大多數環境中，硝化是由氨氧化微生物和亞硝酸鹽氧化微生物的不同組合進行的，它們也分別與氨和亞硝酸鹽競爭。具有非常不同代謝的微生物之間也存在著底物競爭，如硝化螺屬Nitrospiraspp.、『CandidatusBrocadia』 spp.、『Ca.Methanoperedens』 spp.和假單胞菌屬，它們都在競爭亞硝酸鹽（圖3d）。微生物間的相互作用也可以同時合作和競爭：亞硝基硫菌Nitrosopumilusspp. 為『CaScalindua’spp.生產亞硝酸鹽，但兩者都競爭氨（圖3b）。

控制這些相互作用的因素不太清楚。有時，單一的生理特性被用來解釋某些氮轉化微生物在環境中的優勢。例如，在氨耗盡的環境中，氨氧化古細菌相對於細菌的豐度是由於古細菌具有較高的氨親和力。然而，最近有研究表明，陸生細菌「嗜氨芽孢桿菌」『Ca. Nitrospira inopinata』的氨親和力高於所有培養的陸生氨氧化古細菌。然而，執行Comammox過程的微生物並不能主導所有氨耗盡的陸地環境。氮轉化微生物的成功還取決於其他因素，如使用替代底物和細胞能量需求。這些因素在形成氮轉化微生物網絡中可能具有一般作用。

圖3 | 不同生態系統的氮轉換網絡

Fig. 3 | Potential nitrogen-transforming microbial networks in different ecosystems

*圖3a. 公共海水環流氮循環網絡圖

a | 公海環流營養有限地區進行廣泛氮循環。在陽光照射的地表水中，藍藻主要吸收銨和/或有機氮化合物進行生長。浮遊動物分解的病毒裂解釋放出有機氮如尿素由異養細菌礦化成銨。固氮細菌提供額外的銨。在深水中，銨被氧化成硝酸鹽。其中一些硝酸鹽擴散到地表水中，被浮遊植物吸收。

a | The open ocean gyres are vast nutrient-limited regions in which nitrogen is extensively recycled. In the sunlit surface waters, cyanobacteria mainly assimilate ammonium and/or organic nitrogen compounds for growth. Viral lysis and grazing by mesozooplankton release organic nitrogen (for example, urea), which is subsequently mineralized back to ammonium by heterotrophic bacteria. Nitrogen-fixing bacteria provide additional ammonium. In deeper waters, ammonium is oxidized to nitrate. Some of this nitrate diffuses up into the surface waters and is assimilated by phytoplankton.

圖3b. 海水低氧區氮循環網絡

b | 海洋氧氣最低區位於海洋東部邊界，在那裡，風驅動的富營養水上升流刺激地表水的初級生產力。隨後下沉有機物的好氧礦化會耗盡底層水中的氧氣。好氧硝化群落能很好地適應低氧條件，對亞硝酸鹽和硝酸鹽進行氨氧化。由於厭氧氨氧化菌的活性和較小程度的反硝化作用，最低氧區是氮流失的主要區域。反硝化過程涉及複雜的微生物群落。

b | Marine oxygen minimum zones are found on the eastern boundaries of oceans, where wind-driven upwelling of nutrient rich waters stimulates primary productivity in the surface waters. The subsequent aerobic mineralization of sinking organic matters depletes oxygen in the underlying waters. Aerobic nitrifying communities that are well adapted to low oxygen conditions perform ammonia oxidation to nitrite and nitrate. The oxygen minimum zones are major regions of nitrogen loss owing to the activity of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria and to a lesser extent denitrification. Complex communities of microorganisms are involved in the denitrification process.

圖3c. 人造最大生態系統——農田氮循環網絡

c | 最大的人造生態系統是用於農作物生產的農田。豆類是常見的作物，也是蛋白質的重要來源。它們通過釋放有機碳來影響周圍土壤中的微生物群落，並與固氮微生物共生，如慢生根瘤菌。漏入周圍土壤中的銨可以促進好氧氨和亞硝酸鹽氧化。隨後硝酸鹽在土壤中向缺氧區擴散，為氮轉化過程提供燃料，如硝酸鹽還原成銨、一氧化二氮和氮氣。

c | Among the largest man-made ecosystems are agricultural fields that are used for crop production. Legumes are common crops and an important source of protein. They influence the microbial community in the surrounding soil by releasing organic carbon and live in symbiosis with nitrogen-fixing microorganisms, such as Bradyrhizobium spp. Ammonium that leaks out into the surrounding soil can fuel aerobic ammonia and nitrite oxidation. Subsequent diffusion of nitrate to anoxic zones in soil fuels nitrogen-transforming processes, such as dissimilatory nitrate reduction to ammonium, nitrous oxide and dinitrogen gas.

圖3d. 稻田的氮循環網絡

d | 稻田是被水淹沒的農田，用尿素等含氮化合物進行施肥以種植水稻。尿素水解和固氮產生氨，氨在水稻植物根系周圍的氧化土壤中被氧化成硝酸鹽。硝酸鹽隨後擴散到潛在的缺氧土壤燃料過程中，如反硝化、厭氧氨氧化（anammox）和產甲烷產生的甲烷氧化。

d | Rice paddies are flooded agricultural fields, which are fertilized with nitrogen-containing compounds such as urea to grow rice155. Urea hydrolysis and nitrogen fixation generate ammonia, which is oxidized to nitrate in oxic soils surrounding the rice-plant roots. Subsequent diffusion of nitrate to the underlying anoxic soil fuels processes such as denitrification, anaerobic ammonium oxidation (anammox) and the oxidation of methane produced by methanogenesis.

Box3 | 未被發現的生物化學反應

在過去十年裡許多由微生物引起的新的氮轉化反應和途徑被發現，而基於熱力學方面的考慮，應該會存在由微生物引起的更進一步釋放能力的反應（反應15—26）。然而這裡有一些反應可以由已知的酶催化，但有一些反應卻需要迄今為止未被發現的生物化學催化劑（反應15—19,25和26）。例如依賴硝酸鹽的氨氧化作用（反應15）不能通過厭氧氨氧化途徑來進行，因為氨鹽需要首先被氧化成中間產物羥胺或者類似的含氧物質。

反應 15：5NH₄⁺+ 3NO₃^-→ 4N₂+ 9H₂O + 2H⁺(ΔG^0ʹ= −297 kJ mol^-1NH₄⁺)

相似的，激活氨鹽的新的生化途徑對於依賴鐵和錳的氨氧化作用是必需的（反應16—19）。

反應 16：NH₄⁺+ 6Fe³⁺+2H₂O → NO₂^-+ 6Fe²⁺+ 8H⁺(ΔG^0ʹ= −247 kJ mol^-1NH₄⁺)

反應 17：2NH₄⁺+ 6Fe³⁺→ N₂+ 6Fe²⁺+ 8H⁺(ΔG^0ʹ= −303 kJ mol^-1NH₄⁺)

反應 18：NH₄⁺+ 3MnO₂+ 4H⁺→ N₂^-+ 3Mn²⁺+ 4H₂O (ΔG^0ʹ= −60 kJ mol^-1NH₄⁺)

反應 19：2NH₄⁺+ 3MnO₂+ 4H⁺→ N₂+ 3Mn²⁺+ 6H₂O (ΔG^0ʹ= −249 kJ mol^-1NH₄⁺)

相反地，一些歧化反應（反應20—24）可以由已知的微生物用現存的生化機制實施。厭氧氨氧化細菌可以進行對亞硝酸鹽（反應20）和一氧化氮（反應21）的歧化作用。

反應 20：5NO₂^-+ 2H⁺→ N₂+ 3NO₃^-+ 2H₂O (ΔG^0ʹ= −60 kJ mol^-1NO₂^-)

反應 21：10NO + 2H₂O → 3N₂+ 4NO₃^-+ 4H⁺(ΔG^0ʹ= −100 kJ mol^-1NO)

相似的，由亞硝酸鹽轉化成氧化亞氮和硝酸鹽的歧化反應（反應22）、由一氧化氮轉化成亞硝酸鹽和氧化亞氮的歧化反應（反應23）或者是由一氧化氮轉化成硝酸鹽和氧化亞氮的歧化反應（反應24），在理論上可以由需氧的亞硝酸鹽氧化細菌完成。

反應 22：4NO₂^-+ 2H⁺→ N₂O + 2NO₃^-+H₂O (ΔG^0ʹ= −32 kJ mol^-1NO₂^-)

反應 23：4NO + H₂O → 2NO₂^-+ N₂O + 2H⁺(ΔG^0ʹ= −40 kJ mol^-1NO)

反應 24：8NO + H₂O → 2NO₃^-+ 3N₂O + 2H⁺(ΔG^0ʹ= −56 kJ mol^-1NO)

這些微生物可以利用亞硝酸鹽氧化還原酶使亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，而存在於硝化桿菌屬Nitrobacterspp.、硝化球菌屬Nitrococcusspp.、硝化螺菌屬Nitrospiraspp.和硝化刺菌屬Nitrospinaspp.中的亞硝酸鹽還原酶可以將亞硝酸鹽還原為一氧化氮。一氧化氮的氧化可以在硝化桿菌屬Nitrobacterspp.中觀察到，但是這種反應是生物反應還是非生物反應還未可知，而且與該反應有關的酶還不清楚。一氧化氮氧化成亞硝酸鹽的反應可以由含銅的亞硝酸鹽還原酶（由nirk基因編碼）催化，眾所周知這個反應是雙向的。NO還原為N₂O的反應可以由末端氧化酶類催化，而末端氧化酶類在進化上是與NO還原酶有關。

N₂O是一種強效的溫室氣體，在缺氧條件下可以被還原為氮氣，而它在好氧條件下被認為在生物學上性質比較穩定的。有趣的是，從熱力學上講需氧的氧化亞氮被氧化成亞硝酸鹽或者硝酸鹽反應是可行的（反應25、26），但這種反應需要新的生化途徑。

反應 25：N₂O + O₂+H₂O → 2NO₂^-+ 2H⁺(ΔG^0ʹ= −21 kJ/mol N₂O)

反應 26：N₂O + 2O₂+ H₂O → 2NO₃^-+ 2H⁺(ΔG^0ʹ= −89 kJ/mol N₂O)

將催化這些未被發現反應的微生物鑑定出來的唯一方法就是在條件可控的實驗室內培養它們。很顯然，對這些氮轉化微生物的生理生化條件的研究在未來幾年的裡是研究熱點。

結束語

Concluding remarks

確定形成氮轉化網絡的因素需要對所涉及微生物的生理、生態和進化有更深入的了解。所有微生物中只有一小部分被培養，未被培養的大多數可能含有未被發現的代謝途徑（BOX 3）。培養再加上嚴格的生化、生理和基因組特徵，已經改變了我們對關鍵氮循環過程的認識。好氧亞硝酸鹽氧化細菌和厭氧氨氧化細菌具有迄今為止未預料到的代謝多樣性，這使得它們的分類僅僅是好氧亞硝酸鹽氧化劑或厭氧氨氧化劑的分類方式嚴重不足。許多好氧亞硝酸鹽氧化劑可能在環境中以氫氧化劑、氨氧化劑或硝酸鹽還原劑的形式生長。厭氧氨氧化菌也可以使用短鏈脂肪酸、甲胺和鐵（II）作為電子受體，它們可以使用硝酸鹽、錳（IV）和鐵（III）作為電子受體。

相反，越來越多的人認識到單一微生物的完全反硝化是例外，而不是普遍規律，許多微生物是只進行一種或幾種氮氧化物還原反應的專家。專門的氮氧化物還原劑往往缺乏已知的基因，使他們能夠將硝酸鹽一路還原到氮氣。這些專業的氮氧化物還原劑通常被描述為不完整的反硝化劑，這與將氨氧化劑（如亞硝酸鹽）描述為不完整的硝化劑類似。

毫無疑問，按照經典的六氮循環過程對生物體進行分類將變得越來越困難，這就讓觀察者不得不確定生物體的功能。如果我們能從過去幾十年的研究中學到一件事，那就是微生物間沒有嚴格的界限。為了生存，他們會做任何必要的事情。

參考文獻

1. Kuypers M. M. M., Marchant H. K. & Kartal B. The microbial nitrogen-cycling network. Nat Rev Microbiol. 2018, 16: 263-276. doi: https://doi.org/10.1038/nrmicro.2018.9

2. 綜述 | Nature Reviews Microbiology：微生物構成的氮循環網絡（IF:26.819）

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