一文讀懂測序技術在新冠病毒檢測中的應用

隨著世界疫情的發展，多個國家進入公共衛生緊急狀態，全球科學家都在抓緊研究更好的檢測、治療、防控手段。從最初未知β屬冠狀病毒的快速鑑定到病毒序列的完整破譯，再到病毒序列的變異監測，高通量測序技術在疫情防控工作中發揮了非常重要的作用。

測序技術在新冠病毒檢測中的意義和價值

在科學研究方向，採用高通量測序技術，可在第一時間獲取新發未知病毒的基因組序列信息，為突發疫情的防控和後續研究提供了幫助，例如通過構建進化樹揭示其病原相關特性、分析新冠病毒的進化來源、研究新冠病毒的致病病理機制等。

在臨床診斷方向，採用高通量測序技術，可一次性完成細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種病原體檢測[1]。針對在新冠疫情中RT-PCR核酸檢測陰性，但臨床表型高度疑似的患者，可利用高通量測序技術進行進一步確認，同時檢測包括新冠病毒在內的所有可能感染的病原微生物基因序列，為多重感染或繼發感染的相關病原信息提供參考依據。

測序技術在新冠病毒檢測中的原理和方法

具體到新冠病毒的檢測原理，是指針對疑似樣本中所有核酸或來自特定靶標的核酸進行高通量測序，通過生物信息學分析檢測樣本中的所有病原微生物或其靶標序列。因此，採用高通量測序技術，能夠檢測包括新型冠狀病毒在內的所有可能感染的病原微生物基因序列。

目前，基於高通量測序技術在新冠病毒的檢測和研究中可展開的技術路線或方法有3種[2]：宏基因組測序（Meta）、探針捕獲測序（Capture）和多重PCR擴增子測序（Amplicon）。

圖1 新冠病毒高通量測序方法

測序技術在新冠病毒檢測中的應用方案

結合測序技術在新冠病毒檢測中的多種應用方法，華大智造DNBSEQ平臺均已推出配套的整體解決方案，包括一站式核酸提取、自動化樣本製備和高通量基因測序。在今年1月初，華大與中國科學院微生物研究所、山東第一醫科大學通力合作，基於華大智造超高通量測序儀DNBSEQ-T7完成新冠病毒全基因組序列組裝[3]，正是採用了高通量宏基因組測序方法。

圖2 新冠病毒高通量測序整體解決方案

與此同時，艾吉泰康、伯科生物等先後推出了基於華大智造DNBSEQ平臺的探針捕獲試劑盒，支持新冠病毒的探針捕獲測序。

特別地，針對多重PCR擴增子測序方法，華大智造自主開發的新冠多重PCR 擴增子測序Panel（SARS-CoV-2 Full Length Genome Panel），不僅能夠應用於新冠病毒的全基因組組裝、病毒變異檢測、進化研究，還能夠應用於病毒載量極低的極端樣本檢測，最低僅需1M Reads就可獲取病毒全基因組信息，比常規RT-PCR靈敏度更高。此外，相較於高通量宏基因測序而言，該方法的檢測成本更低，更能滿足將高通量測序技術應用於大規模篩查的需求，包括對RT-PCR假陰性樣本進行二次檢測和覆核確診等。

測序技術在新冠病毒檢測中的科研攻關

在全球科學家的共同努力之下，基於華大智造DNBSEQ測序平臺的相關科研工作陸續獲得突破性進展。

圖3 基於DNBSEQ平臺的新冠病毒高通量測序科研攻關

在柳葉刀獲發的一項研究中[4]，研究採集了武漢地區至少3家醫院的9例住院患者的支氣管肺泡灌洗液和培養分離物，基於華大智造DNBSEQ-T7平臺進行高通量測序，對病毒起源展開探討。

另外一項研究在Nature獲發[5]。該研究採用7例重症新冠肺炎患者的樣本，基於華大智造MGISEQ-2000平臺進行高通量測序並展開相關的對比分析，對病毒進入細胞的路徑展開探討。

3月15日，韓國基礎科學研究所 （IBS, Institute of Basic Science） RNA 研究中心聯合國立首爾大學（Seoul National University）和韓國疾病預防控制中心（Korea Centers for Disease Control & Prevention）利用華大智造DNBSEQ 技術聯合 Nanopore 單分子測序技術，對新冠病毒感染的Vero細胞總RNA進行了分析，並結合以往研究給出了新冠病毒轉錄組和表觀轉錄組的高清圖譜[6]。測序數據顯示，華大智造 MGISEQ-200 平臺的測序深度更高，相比單分子測序技術，可以對病毒基因組進行更高深度覆蓋，能夠在更精細水平上研究基因組。

測序技術在新冠病毒檢測中的應用案例

圖4 基於DNBSEQ平臺的首批新冠病毒基因組序列數據

疫情爆發之初，在最早一批提交至全球共享流感病毒資料庫GISAID發布的新冠病毒基因組序列數據中，來自武漢金銀潭醫院的5例數據，是基於華大智造高通量測序儀MGISEQ-2000在第一時間產出，為後續工作提供了第一手資料。

圖5 基於DNBSEQ平臺的新冠病毒基因組序列組裝

1月底，基於MGISEQ-200平臺，某地疾控中心對該地發現的首例新冠肺炎病例樣本進行了高深度測序（300M Reads），成功完成新型冠狀病毒的序列組裝，獲得基因組序列全長29.9kb。而在此前，基於其他測序平臺的下機數據對新冠病毒序列的組裝和拼接效果並不理想。這是因為，在樣本病毒載量較低時，宏基因組測序對數據量的要求比較高，如果測序平臺產出的數據量不足，會導致病毒序列信息獲取不完整，影響後續研究和分析。

圖6 基於DNBSEQ平臺的新冠病毒樣本上機檢測

2月底，全國首例報導的新冠肺炎並腦炎患者成功治癒。在診治過程中，北京地壇醫院重症醫學科、檢驗科及中國疾控中心傳染病所聯合工作組利用華大智造MGISEQ-2000對該病例採集的腦脊液樣本進行了高通量宏基因組測序，排除了其他病原體，獲得了新冠病毒基因組序列，證實了腦脊液中存在新冠病毒，臨床診斷為病毒性腦炎。此病例報導在全球尚屬首例，提醒臨床一線工作人員需要警惕新冠病毒感染可累及中樞神經系統，需要及時進行腦脊液等相關檢查，並完善腦脊液SARS-CoV-2核酸及基因測序等工作，為更全面了解COVID-19做出探索，並積極處理相關神經系統併發症，從而進一步降低危重病人的病死率。

綜上，作為新冠病毒的確診方法之一，基於華大智造DNBSEQ平臺的高通量測序技術在全球疫情的防控中發揮了重要作用和積極影響。目前，由華大智造提供的新冠病毒自動化檢測方案和高通量測序方案已在全球多地展開應用。

FAQ

1.如果病毒核酸序列在疑似樣本中的佔比很低，做高通量測序的話，會不會有影響？

樣本病毒載量對高通量宏基因組測序的影響比較大，如果測序平臺產出的數據量不足，會導致病毒序列信息獲取不完整，影響後續研究和分析。在這種情況下，可以採用多重PCR方法進行建庫和高通量測序，能夠直接對極低載量病毒進行百萬倍富集，適用於各種極端樣本（病毒載量2copies/ml或Ct值>35）；也可以先進行去rRNA處理，然後再進行高通量宏基因組測序，但需要注意的是，去rRNA方法可能會導致的偏向性。

2.建庫是如何操作的？

由華大智造提供的自動化文庫製備方案，包括自動化文庫製備系統MGISP-100、MGISP-960和MGIEasy RNA文庫製備試劑套裝、MGIEasy RNA文庫快速製備試劑套裝、MGIEasy rRNA去除試劑盒等。其中，MGISP-960自動化樣本製備系統，可在8小時內完成96個樣本的自動化測序文庫製備；MGISP-100自動化樣本製備系統則可在8小時內完成16個樣本的文庫製備工作。目前，兩款設備皆可兼容第三方文庫製備試劑盒，均已獲得CB認證、CE認證、cTUVus認證、NMPA認證。

3.請問RNA和DNA需要分開建庫嗎？

如果僅檢測新冠病毒，只需檢測RNA即可，不需要分開建庫，因為新冠病毒是RNA病毒；但如果是針對複合感染病例的檢測，則建議分開建庫，可以同時對DNA和RNA分別進行檢測。

End

參考資料：

[1] DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2020.0008

[2]DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.16.993584

[3]https://db.cngb.org/datamart/disease/DATAdis19/

[4]Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020 Jan 30.

[5]A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Feb 3.

[6]DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.12.988865

來源：生物探索

本期編輯：Tony

本文轉自病毒學界。