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最新在中心上線的發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Cell上的研究，名為「β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway」來自美國國立衛生研究院（NIH）的研究團隊發現，包括新冠病毒在內的β-冠狀病毒能夠劫持溶酶體作為自身傳播工具，同時導致溶酶體中降解酶的失活。細胞中的溶酶體（lysosome）被稱為細胞的「垃圾處理廠「，它通過消化細胞中錯誤摺疊的蛋白、「廢舊」的細胞器，產生胺基酸，為細胞合成新的蛋白質提供原料。溶酶體介導的蛋白降解也是細胞消滅病毒的有力工具之一。然而，日前美國國立衛生研究院（NIH）的研究團隊發現，包括新冠病毒在內的β-冠狀病毒，能夠「劫持」溶酶體作為自身傳播的工具，同時導致溶酶體中降解酶的失活，並且擾亂抗體呈現通路。研究人員表示，這一研究結果有助於解釋COVID-19患者中出現的細胞和免疫異常，並且可能提供開發治療手段的全新思路。
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摘要
β-冠狀病毒是一類單正鏈包膜RNA病毒，包括導致COVID-19的SARS-CoV-2。既往許多研究揭示了它們的細胞進入和複製途徑，但是它們排出細胞的方式尚不清楚。使用成像方法和病毒特異性報告基因，我們證明了β-冠狀病毒利用溶酶體轉運排出細胞，而不是利用其他包膜病毒更常用的生物合成分泌途徑。這種非常規的細胞排出方式受到Arl8b（Arf-like small GTPase）的調控，並且可以被Rab7 GTPase競爭性抑制劑CID1067700所阻斷。β-冠狀病毒的這種非溶解釋放導致溶酶體脫酸、溶酶體降解酶失活以及抗原呈遞途徑的破壞。本研究發現，β-冠狀病毒利用溶酶體轉運排出細胞，這為深入探索在患者中觀察到的細胞和免疫異常提供了啟發性的見解，並提出了新的治療模式。
正文
β-冠狀病毒是一類單正鏈包膜RNA病毒，是冠狀病毒科（Coronaviridae）的四個病毒屬之一。這些病毒具有感染多種不同細胞類型的能力，包括肺、心血管、肝、胃腸、中樞神經和免疫系統中各種類型的細胞，這會導致複雜的多器官疾病表現，並且可能因人而異（Puelles et al., 2020; Ziegler et al., 2020）。尤其是在免疫系統方面，這些病毒似乎能夠逃逸機體對病原體產生的典型先天性免疫和適應性免疫反應（Vardhana and Wolchok, 2020）。目前尚無任何治癒方法，抗病毒治療的選擇也很少（Williamson et al., 2020），是否可以通過自然途徑或通過疫苗接種產生持久的免疫應答以對抗感染仍然是一個懸而未決的問題（Long et al., 2020）。
缺乏抗病毒治療的主要原因之一在於，人們缺乏有關β-冠狀病毒與宿主細胞結合界面的知識。一旦病毒包膜與質膜和/或內體膜融合，並將病毒RNA基因組釋放到細胞質中，細胞就能轉錄、翻譯產生細胞的非結構蛋白和結構蛋白。非結構蛋白在內質網膜上組裝並複製產生病毒RNA（Snijder et al., 2020; Snijder et al., 2006）。儘管既往研究揭示了冠狀病毒進入和複製的大量分子細節，但我們仍然對新組裝的冠狀病毒如何從細胞內排出知之甚少，包括它們利用的細胞途徑以及它們是否誘導產生胞溶作用等（Fung and Liu, 2019; Machamer, 2013; Tooze et al., 1987）。
病毒感染細胞之後，會利用細胞生產蛋白的機制，合成自身複製所需的蛋白，在細胞內增殖，最後脫離細胞去感染其它的細胞。所有β-冠狀病毒排出細胞途徑均始於新合成的病毒基因組RNA，該病毒基因組RNA包被有病毒N蛋白，通過出芽方式進入內質網腔（ER）和ER-高爾基體中間腔（ERGIC）（Cohen et al., 2011; McBride et al., 2007; Perrier et al., 2019; Tooze et al., 1987; Tooze et al., 1988）。之後，病毒顆粒被包含病毒M、E和S跨膜結構蛋白的宿主膜所包被（de Haan et al., 1998; Ruch and Machamer, 2012; Siu et al., 2008）。一旦進入ER / ERGIC，病毒顆粒便進入高爾基體和反面高爾基網絡（TGN）進行糖基化和其他翻譯後修飾（Fung and Liu, 2018; McBride et al., 2007; Oostra et al., 2006; Tooze et al., 1987）。研究人員推測在高爾基體/TGN之後，冠狀病毒利用生物合成分泌途徑（biosynthetic secretary pathway）的囊泡結合細胞質膜並排出細胞（Machamer, 2013; Tooze et al., 1987），類似於其他包膜RNA病毒，例如丙性肝炎病毒、登革熱病毒和西尼羅河病毒（Ravindran et al., 2016; Robinson et al., 2018）。此前，科學家們以為冠狀病毒也採用同樣的方式脫離細胞。
在此，美國國立衛生院（NIH）的科學家對小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus, MHV）的脫離方式進行了研究。本研究探索了β-冠狀病毒的排出途徑，研究者發現這類病毒不是通過生物合成分泌途徑排出細胞，而是利用溶酶體，以Arl8b依賴性的胞吐途徑釋放到細胞外環境中。這與其他RNA包膜病毒不同。其他RNA包膜病毒要麼經生物合成分泌途徑，要麼直接通過與質膜融合和出芽排到細胞外（Robinson et al., 2018; Ravindran et al., 2016; Pornillos et al., 2002）。與先前的報導（Machamer, 2013; McBride et al., 2007; Tooze et al., 1987）一致。
「令我們驚訝的是，這些冠狀病毒仍然能夠正常脫離細胞。」這一研究的負責人，NIH國立心肺血液研究所（NHLBI）的Dr Nihal Altan-Bonnet說，「這是我們獲得的第一個線索，冠狀病毒可能在使用另外的通路。」
結果
本實驗表明，分泌途徑在被β冠狀病毒感染的細胞中仍然具有很強的功能，新組裝的病毒顆粒會通過出芽進入ER / ERGIC管腔，並在感染初期轉運至高爾基體/TGN。但是，在達到高爾基體/ TGN後，他們的實驗表明，β-冠狀病毒輸送至溶酶體，並使用胞吐溶酶體排出細胞，而不是生物合成的分泌途徑（圖1）。他們還顯示了GRP78/BIP ER分子伴侶可通過此途徑與β-冠狀病毒共釋放，從而增強冠狀病毒的感染性（Chu et al., 2018; Ha et al., 2020）。由於病毒利用了溶酶體胞吐作用的結果，研究人員證明了晚期內體/溶酶體的脫酸和溶酶體蛋白酶的失活。尤其值得注意的是，他們發現溶酶體的生理紊亂對宿主細胞有重要的功能影響，包括抗原呈遞途徑的破壞。
▲圖1
進一步的顯微鏡成像研究顯示，冠狀病毒會被運送到溶酶體中，並且在那裡聚集。可是溶酶體裡的環境通常是強酸性，那裡有很多消化蛋白的酶。冠狀病毒如果通過溶酶體脫離細胞，為什麼不會被溶酶體消化掉？
為此，研究人員用能夠顯示pH值的染料對被MHV感染的細胞進行了染色，他們發現，被MHV感染的細胞中，溶酶體的pH值顯著升高，未感染的細胞中溶酶體的平均pH值為4.7，而被MHV感染的細胞中溶酶體的pH值則提高到5.7。以往的研究顯示，溶媒體中的酶的活性與pH值有很大關聯，pH值的微小上升就可以導致蛋白酶活性的顯著下降。對蛋白酶活性的檢測表明，被MHV感染的細胞中，溶酶體內的蛋白酶活性降低了40%。
所以，MHV病毒感染可以通過提高溶酶體的pH值，降低其中蛋白酶的活性，讓溶酶體可以被病毒用於脫離細胞。研究人員還發現新冠病毒的ORF3a蛋白也會靶向溶酶體並且可能導致溶酶體酸性降低。
另外，研究人員在本文中報導了KDEL受體及其貨物——含有ER伴侶GRP78/BIP和鈣網蛋白（未顯示）的KDEL序列與冠狀病毒被選擇性地共同轉運至溶酶體，並與它們共同釋放到細胞外（圖2）。相反，其他分泌途徑的駐留蛋白，如甘露糖苷酶II、TGN46，Golgin97、ERGIC53或CI-MPR仍然在細胞內，不與溶酶體共同運輸（圖3和圖4）。在ER，GRP78/BIP作為分子伴侶可能會結合併幫助摺疊新合成的冠狀病毒蛋白。令人驚訝的是，研究人員的發現表明當冠狀病毒通過胞吐溶酶體排出時，GRP78/BIP與病毒蛋白的這種相互作用得以維持。值得注意的是，跟據既往報導，在進入過程中，GRP78/BIP與SARS/MERS的相互作用增強了這些病毒的感染性（Chu et al., 2018），並且，據推測SARS-CoV2的S蛋白與GRP78/BIP直接結合（Ha et al., 2020）。因此，通過胞吐溶酶體維持這種相互作用的一個優點可能在於，冠狀病毒一排出細胞外就準備好了感染附近的細胞，而無論細胞外是否存在GRP78 / BIP，都無法限制冠狀病毒感染其他細胞。
▲圖2
▲圖3
▲圖4
鈣可調節溶酶體的胞吐作用（Rodríguez et al., 1997）。當細胞內的鈣儲存與BAPTA-AM螯合時，他們發現MHV排出細胞的水平下降了約~2-log。但是複製也減少了（圖5F）。另一方面，突觸結合蛋白VII（被認為是溶酶體與質膜融合的鈣依賴性觸發物）（Martinez et al., 2000）的耗盡導致病毒的排出減少，但不會顯著地影響病毒複製（圖5G和5H）。在β-冠狀病毒的釋放中，鈣、突觸結合蛋白和其他成分發揮的確切作用還有待進一步研究。
▲圖5
溶酶體蛋白水解酶的活性對於許多關鍵的細胞過程至關重要，包括細胞自噬、細胞運動、膽固醇代謝、T細胞釋放細胞殺傷酶、巨噬細胞降解病原體，以及細胞呈遞自身/非自身抗原。溶酶體酶的穩定性和酶活化需要溶酶體酸化，即使是pH值的小幅增加，也足以抑制這些酶並停止其關鍵的生物學功能（Mindell, 2012）。在此，研究人員顯示，感染β-冠狀病毒的細胞發生了溶酶體的顯著脫酸，並伴隨著溶酶體酶活性的降低（圖6B-F）。此外，他們發現，受感染的細胞比未受感染的細胞向細胞外環境分泌了更多的溶酶體酶。脫酸的機理目前正在研究中。一種可能性是溶酶體因為裝載過多的貨物（即病毒）和/或質子泵或離子通道運輸中的幹擾而發生了間接脫酸（Ballabio and Bonifacino, 2020）。另一種可能性是，脫酸可能是特定冠狀病毒蛋白作用的結果，其行為類似病毒孔蛋白。
▲圖 6
既然冠狀病毒通過溶酶體通路脫離細胞，那麼抑制溶酶體通路能不能減少病毒的釋放呢？為此，研究人員使用一種名為CID1067700的抑制劑來抑制溶酶體的生成。他們發現，雖然這種抑制劑不會影響細胞的活力，或者病毒的感染和複製，但是它顯著降低了病毒的釋放。在4 µM時將病毒釋放降低了100倍，在40 µM時病毒釋放降低了1000倍。
本研究的發現在此表明，感染β-冠狀病毒的細胞溶酶體功能改變可導致抗原呈遞的幹擾並導致免疫應答反應發生改變（圖7）。因為COVID-19大流行產生的大量研究表明，冠狀病毒誘發的免疫應答可能是異常的和有問題的（Vardhana and Wolchok, 2020）。確實，臨床醫生和基礎免疫學家難以根據他們目前對病毒或癌症的免疫應答知識來解釋觀察到的結果（Vardhana和Wolchok）。如果我們能夠充分認識冠狀病毒的細胞生物學及其在改變抗原呈遞方面的功能結果，可能會開闢新的研究路徑，例如探究NK細胞對冠狀病毒感染細胞的反應。在感染HIV-1的患者中，表達KIR3DS1的NK細胞可能與延緩愛滋病進展有關（Martin et al., 2002），或與H1N1感染的嚴重程度加重有關（Aranda-Romo et al., 2012）。HLA-F（一種已知激活KIR3DS1並抑制KIR3DL1受體的配體）的開放構象體呈遞增加的發現，可能對冠狀病毒感染引發的免疫反應產生正面或負面的影響（Garcia-Beltran et al., 2016）。此外，這種通過溶酶體運輸的排出細胞方式也可能導致需要破壞酸化的溶酶體Toll樣受體信號轉導通路（de Bouteiller et al., 2005）。最近有研究發現，一種非包膜病毒在其排出細胞時也使用了溶酶體（Fernández de Castro et al., 2020）。本研究發現了溶酶體在宿主細胞生理過程（包括抗原呈遞和先天免疫）中發揮的功能作用，這很可能會讓人們發現越來越多的病毒利用這些細胞器排出細胞。
▲圖 7
小結
總而言之，本研究結果表明，β-冠狀病毒使用溶酶體排出細胞，這是研究人員此前未曾預料的。這可能會開闢新的治療途徑，以減輕冠狀病毒感染和病毒的緩慢傳播，例如靶向溶酶體運輸和生物發生的調節因子（如Arl8b和Rab7）、逆轉脫酸反應和/或增強對抗溶酶體缺陷的免疫應答反應等。
「溶酶體通路提供了一種構建靶向療法的全新思路。」 Dr Altan-Bonnet說。她的研究團隊正在進行進一步研究，檢驗這類藥物幹預能否有效降低冠狀病毒的傳播，以及是否有已經獲批的藥物能夠阻斷這一通路。她同時表示，這一研究可能幫助防治未來由其它冠狀病毒引起的流行病。
相關論文信息
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▌論文標題：
β-Coronaviruses Use Lysosomes for Egress Instead of the Biosynthetic Secretory Pathway
▌論文網址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)31446-X#%20
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.039
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