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冠狀病毒科是導致人類疾病的一大病毒家族，目前已發現了7種已知的人類病原體，但至今卻沒有一款獲得批准的疫苗上市，治療選擇也十分有限。季節性循環的人類冠狀病毒(HCoV) OC43、HKU1、229E和NL63可引起人類輕微的、普通的類感冒呼吸道感染。然而SARS-CoV-1和MERS-CoV可導致急性呼吸窘迫症候群和死亡，死亡率在10-40%之間。SARS-CoV-2雖然沒有那麼致命，但比前兩者傳播能力強得多。由於SARS-CoV-2和其他冠狀病毒對全球健康的嚴重影響，因此了解它們在感染期間如何劫持宿主細胞機制並應用這一知識開發新的治療策略至關重要。
2020年12月8日，Cell雜誌在線發表了一篇來自Ruofan Wang等人的研究成果：Genetic screens identify host factors for SARS-CoV-2 and common cold coronaviruses，本研究使用的正交策略（篩選突變），在人類細胞中使用進行了全基因組CRISPR敲除(KO)篩選（CRISPR screen）。通過對感染SARS-CoV-2和兩種季節性循環的普通感冒冠狀病毒OC43和229E的細胞進行篩查，最終揭示了宿主途徑、病毒-宿主相互作用的新方面，並確定了宿主導向的抗病毒治療靶點。
重要的是，研究人員還將功能基因組學的方法擴展到與人類距離較遠的冠狀病毒科成員，以探索病毒家族之間的共性和差異。
主要內容
當冠狀病毒與人類細胞結合併發生膜融合時，特定的細胞蛋白質會被病毒劫持，並在病毒生命周期中發揮關鍵作用。例如，血管緊張素轉換酶2 (ACE2)被用作NL63、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的病毒進入受體。此外，細胞蛋白酶，如TMPRSS2、組織蛋白酶L和furin對於裂解幾種冠狀病毒的病毒S蛋白促進膜融合也十分重要。
之前的研究雖然已經系統闡明了病毒生命周期後期病毒-宿主的相互作用，揭示了病毒和細胞蛋白質之間的物理關係，但它們並沒有提供關於這些宿主成分對病毒複製重要性的即時信息。
而在該研究中，研究人員利用CRISPR Screen這種方法，正確地篩選出了三種冠狀病毒獨特的病毒進入因子：ACE2（用於SARS-CoV-2）、氨肽酶N（用於229E）和糖胺聚糖（用於OC43）。
此外，研究確定磷脂醯肌醇磷酸鹽生物合成和膽固醇穩態是支持三種冠狀病毒感染的關鍵宿主途徑。磷脂醯肌醇激酶和膽固醇穩態的藥理學作用也抑制降低了以上三種冠狀病毒的複製。相反，在SARS-CoV-2感染中，溶酶體蛋白TMEM106B似乎是唯一只被SARS-CoV-2識別的。
SARS-CoV-2需要細胞膽固醇才能有效進入
該研究中的藥理實驗表明，SARS-CoV-2需要細胞膽固醇才能有效進入。這一觀察結果也得到了其他研究對保護SARS-CoV-2感染的幹擾素刺激基因篩選的支持，這些篩選發現膽固醇25-羥化酶(CH25H)是最熱門的基因之一。
值得一提的是，之前的研究表明，布尼亞病毒和漢坦病毒感染時，膽固醇穩態也與這些病毒進入和膜融合有關，這也提示了不同病毒家族一些共同的前病毒功能。
磷脂醯肌醇生物合成是冠狀病毒感染的一個重要途徑
研究人員發現PI3K複合物是一個新的關鍵宿主因子，可能具有泛冠狀病毒功能。由於冠狀病毒參與了包括囊泡運輸和自噬在內的多個細胞過程，因此尚不清楚冠狀病毒是否在進入和/或病毒複製/轉錄複合物所需的雙膜囊泡生成過程中劫持了PI3K通路。
值得一提的是，在一些對藥物篩選在利用的研究中，研究人員鑑定了大約100種抑制SARS-CoV-2複製的化合物。值得注意的是，其中有PIKfyve抑制劑，蛋白酶抑制劑和膽固醇穩態調節劑。因此，該研究功能基因組數據表明，這些化合物的觀察效果可能是由於抑制關鍵宿主因子。
其他研究忽略了許多重要的宿主因子
研究人員認為，之所以其他類似的研究忽略了許多至關重要宿主因子，可能是由於選擇的實驗系統不同。
Wei等人對非洲綠猴細胞系VeroE6進行了全基因組CRISPR篩選。除了真正的進入因子ACE2和組織蛋白酶L，篩選結果大量顯示了染色質修飾因子，如HMGB1和SWI/SNF染色質重塑複合體。前者被證明可以調節ACE2的轉錄，從而間接調節VeroE6對SARS-CoV-2感染的敏感性。在人類細胞中進行的任何CRISPR篩查中，HMGB1均未顯著富集，這表明受體表達水平的調控可能與物種或細胞類型有關。
Daniloski等和Zhu等在A549-ACE2細胞中進行了篩選。兩項研究都鑑定了ACE2、組織蛋白酶L和與核內體酸化(例如V-ATPase的亞基)或核內體蛋白分類和循環相關的基因。後者被證明對ACE2細胞的表面表達至關重要，因此可能間接影響病毒的進入。
有新的證據表明，SARS-CoV-2可以通過不同的途徑進入，這取決於靶細胞上TMPRSS2的水平以及病毒刺突蛋白多鹼性S1/S2位點的突變。
SARS-CoV-2 S蛋白的裂解可以通過TMPRSS2發生在質膜上，也可以通過組織蛋白酶發生在內溶酶體上。因此，足夠的TMPRSS2水平可能會減少對組織蛋白酶和其他與內溶酶體活性相關的因素的需求，該研究的篩選支持了這一假設，該篩選是在TMPRSS2過表達的背景下進行的，並沒有發現組織蛋白酶是關鍵的宿主因子。
相比之下，A549和VeroE6細胞不表達可檢測到的TMPRSS2水平，因此病毒可能會優先依賴組織蛋白進入這些細胞，這是在這些細胞中篩選的結果。而作為SARS-CoV-2天然靶細胞的鼻、肺上皮細胞可表達高水平TMPRSS2。
總之，研究展示了在TMPRSS2陽性遺傳背景下進行的宿主因子篩選。因此，它揭示了對SARS-CoV-2感染至關重要的宿主因子，這些宿主因子可能比迄今為止在其他遺傳背景中發現的宿主因子更具生理相關性。
此外，研究比較篩查突出了SARS-CoV-2與普通感冒冠狀病毒OC43和229E之間的共性和差異。特別地，這種比較表明可識別PI3K複合物和膽固醇穩態作為今後的抗病毒治療目標，以尋求發展宿主導向的全血細胞病毒治療。
CRISPR Screen：病毒-宿主互作研究神器
近幾年，隨著CRISPR-Cas基因編輯技術的興起，各種CRSIPR的應用領域也逐漸拓寬，被廣泛地應用於基因敲除、敲入，DNA甲基化，轉錄激活、抑制，組蛋白修飾以及全基因組篩選等領域。而所謂的CRISPR Screen便是基於CRISPR-Cas9技術，設計成千上萬個sgRNA， 在全基因組範圍內進行基因編輯實驗，篩選出大量突變細胞，識別與特定表型相關的基因。
在病毒-宿主互作研究領域，基於CRISPR Screen技術的宿主全基因組sgRNA文庫高通量篩選平臺，可快速發現參與病毒侵入、複製等生物學過程的關鍵宿主因子，進而明確病毒-宿主分子相互作用進而揭示病毒的生命周期，可為病毒-宿主相互作用的研究提供十分強大的研究工具。
例如：2018年5月Nature雜誌發表了來自美國聖路易斯華盛頓大學醫學院的Diamond教授的研究：Mxra8 is a receptor for multiple arthritogenic alphaviruses。該研究利用CRISPR Screen技術對人類細胞進行全基因組水平篩選，鑑定並證明了基質重塑相關蛋白8（Matrix Remodeling Associated 8, MXRA 8）是基孔肯雅病毒等致關節炎類甲病毒的一種哺乳細胞侵入受體。
2019年5月16日，Cell雜誌發表了來自中國科學院微生物研究所高福團隊與北京大學魏文勝團隊，首都醫科大學附屬北京兒童醫院謝正德團隊聯合研究的文章：Human neonatal Fc receptor is the cellular uncoating receptor for Enterovirus B。該研究利用CRISPR Screen技術，發現人類新生兒Fc受體（FcRn）是多個B族腸道病毒的通用脫衣殼受體，並通過解析病毒與其吸附受體和脫衣殼受體的電鏡結構，闡明了腸道病毒感染宿主細胞的入侵機制。該成果在B族腸道病毒的藥物開發和致病研究，非囊膜病毒的入侵機制方面均具有重要意義。
總而言之，隨著CRISPR Screen技術越來越多地應用於病毒-宿主互作領域的研究，為理解病毒的生命周期和開發宿主導向的治療藥物提供了重要的見解！另外，利用這一策略也可以揭示潛在的泛冠狀病毒或其他病毒家族的通用宿主因子，從而闡明抗病毒治療的靶點，以對抗當前和未來可能爆發的疫情。
參考文獻
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