2020年9月，以色列魏茨曼研究所Asaph Aharoni教授團隊和德國萊布尼茨植物遺傳學和作物植物研究所（IPK）在Nature Genetics期刊發表的題為 「Analysis of wild tomato introgression lines elucidates the genetic basis of transcriptome and metabolome variation underlying fruit traits and pathogen response」的研究成果，該研究以秘魯野生番茄品種（LA0716或PI246502）和現代栽培番茄品種M82構建的遺傳群體為研究對象，運用轉錄組學+LC-MS非靶向代謝組學確定了與數百種轉錄物和代謝物水平相關的基因組位點，對促進類黃酮在果實果皮組織中積累的相關位點和基因進行了分析，為理解番茄果實成熟過程中的代謝和病原菌抗性提供了遺傳框架，並為研究關鍵果實品質性狀提供了依據。
中文標題：利用野生番茄漸滲系闡明轉錄組和代謝組變異對果實性狀和病原菌響應的遺傳基礎的潛在影響
研究對象：番茄的果實和果皮
發表期刊：Nature Genetics
影響因子：27.603
發表時間：2020年9月28日
為滿足市場和經濟需求，經過人類千百年的馴化和育種後，番茄的表型和味道都有了顯著的改良。但是育種的連續選擇導致遺傳多樣性降低，一些優良的果實性狀，包括質地、營養、香氣和風味物質等隨之喪失，甚至還包括果實對各種病原體的抵抗力。而野生番茄種代表了大量在馴化過程中丟失的理想性狀的豐富基因庫。因此，近年來研究人員和育種者致力於使用野生番茄親緣種尋找將這些性狀重新引入商業品種所需的遺傳庫。但就目前來看，需要更先進的群體定位和更深入的多組學表型來識別導致複雜性狀的遺傳線索。
1、580個漸滲系的番茄多組學數據資源獲取及分析
作者通過使用高解析度質譜的非靶向代謝組學和RNA測序相結合的方法，分析了580個滲入系（504個BILs和76個ILs）在兩個果實發育階段，即破色階段（開花後約44天）和紅熟階段（開花後約48天）的果皮組織（圖1a）中代謝物的組成和基因表達，並利用灰黴病菌對紅果期番茄果實的進行病原體敏感性分析及定量分析。線性模型表明轉錄物、代謝物和灰黴病菌感染後的抗性評分與特定作圖區的漸滲發生有統計學關聯（概率對數的顯著性閾值（LOD）≥5，FC≥2；圖1c）。這些QTL用於推斷基因-轉錄物-代謝物-病原體敏感性相互作用（圖1d）。
2、通過表達QTL分析揭示果實發育過程中的基因調控相互作用及S.pennellii漸滲導致與成熟過程相關的基因表達變化
群體的轉錄組學揭示了S. pennellii滲入的存在和特定基因的表達之間的顯著聯繫（圖2a）。共檢測到582個轉錄本具有顯著的順式轉錄因子，496個轉錄本顯示至少一個顯著的反式轉錄因子。基於LOD值的eQTL在順式和反式位置分別產生總共2,202和1,692個eQTL。
研究表明，響應S. pennellii基因滲入而上調的轉錄本庫顯著富集於次生代謝、光合作用、纖維素合成、角質層形成、脂肪酸生物合成、細胞分裂素、油菜素內酯信號轉導和生物脅迫反應中，而由於基因漸滲而下調的基因與澱粉合成、成熟調節和苯丙氨酸代謝等有關（圖2a）。FUL1的4個靶基因（肉桂醯-輔酶a還原酶、羥基肉桂醯轉移酶和果膠酸裂解酶同源物）存在差異表達（圖2b），可能是包括FUL1基因本身在內的FUL1基因座的基因融合導致它們的表達下調。FUL2基因座及其靶基因也存在類似的模式。雖然RIN基因的滲入沒有引起eQTL熱點的出現，但RIN激活的兩個基因（ACC合酶4（ACS4）和一個假定的乙烯反應性蛋白酶抑制劑1（ER1））映射到了RIN位點（圖2c）。相關分析進一步支持了S. pennellii基因滲入對RIN、FUL1和FUL2基因座的差異影響。
3. 代謝組學確定了果實成熟過程中次級代謝的酶促瓶頸
利用液相色譜-高解析度四極杆飛行時間質譜聯用（LC-qTOF-MS）對破色階段和紅熟階段的果皮組織進行代謝組學分析。分析結果顯示，在兩個不同階段的樣品中分別檢測出526和1019種半親脂性代謝物。從eQTLs觀察，熱點（hotspot）中出現多種代謝物的mQTLs（圖3）。這些觀察結果強調了遺傳關聯隨果實發育到成熟階段的代謝過渡而發生變化的時間動態。所觀察到的mQTL常與關鍵調控或酶促基因位點相關。
Bin 424的mQTL是代謝變化最大的hotspot區域，共有249個代謝物差異積累。其中至少22種黃酮類化合物在紅果期顯著下調，蘆丁和4種山奈酚苷上調。在果實發育破碎期蘆丁和山奈酚苷類含量也有明顯的上調，表明該基因座（CHI1）在果實發育和成熟過程中具有持續作用。而CHI1的表達被認為是番茄果實成熟過程中類黃酮生物合成的瓶頸。
4. 果實成熟過程中防禦型甾族糖苷生物鹼（SGA）成分的化學變化
在番茄中，苦澀的α-蕃茄鹼是葉片和綠色果實中主要的甾族糖苷生物鹼（SGA）。α-番茄鹼在番茄從綠色果實向紅色果實的轉變過程中轉化為苦參糖苷A及其衍生物（圖4a）。我們的多基因位點數據強調了與α-番茄鹼及其下遊衍生物變化相關的多個位點（圖4b），數據指出了成熟過程中產生SGAs的生物合成途徑中關鍵酶的功能，包括可催化α-番茄鹼羥基化的糖生物鹼代謝31（GAME31），以及一個介導乙醯氧基-羥基番茄鹼形成七葉皂苷的尿苷二磷酸糖基轉移酶家族成員（GAME5）。
在GAME31基因的基因組區域（bin 87；2號染色體）中，S. pennellii滲入會導致羥基番茄鹼的增加，以及α-番茄鹼水平的相應降低（圖4b）。為了測定QTL是否源自改變的GAME31表達或S. lycopersicum和S. pennellii變異體的酶活性，我們用重組S. pennellii GAME31酶進行了活性分析。酶活性測定表明，QTL定位中SGA水平的變化可能是GAME31基因表達（可能在啟動子區）變化的結果。
在番茄果實成熟過程中，乙醯氧基-羥基番茄鹼被糖基化形成七葉皂苷A（圖4a）。在Bin 1,006注釋的總共30個基因中，我們檢測到三種推定的UDP糖基轉移酶，其中只有GAME5在破色階段和橙色階段之間表現出高度上調。基於VIGS分析的結果，紅色成熟果實中基因GAME5的沉默導致七葉皂苷A減少，乙醯氧基-羥基番茄鹼（七葉皂苷A前體）的水平顯著增加（圖4d）。這表明GAME5參與了乙醯氧基-羥基番茄鹼向七葉皂苷A的轉化。作者在大腸桿菌中表達GAME5以確定糖基轉移酶活性，並用乙醯氧基-羥基番茄鹼和UDP-葡萄糖進行重組酶分析。該實驗結果為七葉皂苷A的形成，以及為GAME5作為乙醯氧基-羥基番茄鹼UDP-葡糖基轉移酶的活性提供了強有力的證據（圖4e）。
圖4 | 在番茄果實成熟過程中介導化學物質向成熟相關SGAs轉移的酶
5. 成熟果實對灰黴病敏感性的遺傳關聯
通過在真菌接種紅色成熟階段的果實後測量病變區域的直徑，對整個BIL和IL集合對灰葡萄孢的敏感性進行評分，番茄灰黴病抗性評分（BRS）通過每個定位bin對灰黴病感染的影響來描述。與抗性增加相關的QTL包括6號染色體上bin 542（跨越88個帶注釋的基因）的基因組區域和9號染色體上bin 820和bin 862之間的較大區域之間，在bin 827和bin 859有兩個顯著最大值（包括另外289個帶注釋的基因）。相反，與灰黴病菌感染的敏感性增加相關的兩個QTL分別在bin 18和19區域中包含1,669個帶注釋的基因，在bin 23和24區域中包含58個基因。
6. 整合全種群真菌抗性數據可確定果實病原體關聯的要素
作者應用轉錄組學+代謝組學的多組學聯合分析方法預測了BILs和ILs對灰黴病菌感染的抗性，並使用正則化回歸分析估計了每個數據集對預測灰黴病抗性的總貢獻（圖5a）。結果表明轉錄組數據是灰黴病菌抗性的主要預測因子（預測貢獻約33%；圖5b），接著是紅熟期的代謝物水平（~7%）。破色期的代謝物水平以及漸滲圖譜數據在一定程度上有所貢獻（分別約為5%和3%）。
作者進一步使用加權相關分析，構建了一個轉錄物和代謝物的網絡，這些轉錄物和代謝物共享顯著的QTL，並表現出與BRS相關的變化（圖6a）。候選轉錄物和代謝物形成了兩個緊密共表達的網絡群落。真菌抗性相關群落包括110個轉錄本，其中包括番茄主要的類黃酮柚皮苷查爾酮和兩種類黃酮苷（3′,5′-di-C-glucosylphloretin 和phloretin-trihexose）。灰黴病菌易感性相關網絡群落包括99個轉錄物和7個代謝物，其中一個被注釋為3，4-二羥基苯甲醯基-d-吡喃木糖苷。
圖6 | 網絡分析揭示灰黴病菌抗性相關基因和代謝產物
7. 泛酸在番茄果皮中的積累促進了對番茄灰黴病菌的抗性
在真菌抗性相關網絡群落中發現的六種代謝物代表了灰黴病菌抗性機制的潛在新元素。通過LC–qTOF–MS對果實提取物進行檢測分析後，發現泛酸（維生素B5；圖6a）可作為一種抗真菌候選代謝物。使用不同濃度的泛酸進行感染抑制試驗，從而驗證了其對灰黴病菌生長的影響，顯示在10 M和100 M泛酸濃度下真菌生長分別減少了10-40%。
8. 選定候選基因的沉默導致對灰黴病菌的易感性增加
為了進一步表徵抗性和易感性相關基因，作者分析了果實組織和發育階段特異性表達，以及成熟抑制劑（rin）和非成熟（nor）成熟突變體中以及用乙烯信號抑制劑1-甲基環丙烯（MCP）處理後的表達變化（圖7），結果顯示存在四個主要的基因表達簇。聚類分析表明，屬於抗性子網絡的轉錄本主要在綠色果實的果皮和果肉組織中都有表達，在非成熟突變體果實中表達上調。然而，大多數易感性相關的子網基因是成熟簇的一部分，在橙色和紅色成熟階段上調，在rin和nor突變體中主要下調。
另外，作者選擇了三個潛在的抗性候選基因（ACO5，ACD2和4CL-Like）進行基因沉默，同時監測ACO5，ACD2和4CL-Like基因的相對轉錄水平。真菌接種離體果實後3 d，pTRV：ChlH：ACO5，pTRV：ChlH：ACD2和pTRV：ChlH：4CL-Like果實的壞死病灶分別增加了42.8％，36.2和47.4％（與對照組相比）。結果表明，通過網絡分析確定的三個基因可能是成熟番茄果實中真菌抗性所必需的。
探索從野生水果到栽培水果的軌跡對於全面理解水果新陳代謝和人類選擇對番茄果實正面和負面品質性狀的影響是必不可少的。本研究藉助多組學技術，通過野生番茄基因組區域的滲入，研究了基因表達、代謝產物和病原體敏感性的變異對栽培物種遺傳背景的影響。
首先，在成熟的番茄果實中發現了GAME31和GAME5可作為SGA途徑的核心酶，通過這些中間體和酶活性，即作為綠色番茄果實中存在的基本抗營養和防禦生物鹼α-番茄鹼，在果實成熟期間被轉化為七葉皂苷和番茄紅素。這種化學轉變是非常重要的，以減少α-西紅柿的苦澀味以及抵消對防禦性水果代謝物的暫時需求。此外，分析了促進健康的類黃酮在水果皮膚組織中積累有關的基因座和基因。觀察到的基因表達和代謝變化（例如防禦代謝產物的積累）也影響了複雜的表型，例如病原體抗性。
同時，作者還提供了番茄果實最常見的真菌病原菌之一灰黴病菌（Botrytis Cinerea）獲得的抗性的分子數據，並鑑定了與提高番茄灰黴病菌抗性相關的代謝物和基因。本文探討了3′，5′-葡糖基根皮素（3′,5′-di-C-glucosylphloretin）和泛酸在果實抗灰黴病中的作用，研究者認為泛酸對灰黴病菌生長的直接影響表明泛酸本身是一種保護性代謝物。灰黴病抗性也與病原體反應相關轉錄物的協同變化有關。另外，所選候選物（即ACD2、ACO5和4CL-Like）的功能特性揭示了它們在果實抗灰黴病中的作用。
本研究利用秘魯野生番茄品種（LA0716或PI246502）和現代栽培品種番茄M82構建了番茄的作圖群體。通過對580個系的轉錄組和代謝組分析，結合病原體敏感性分析，確定了與數百個轉錄本和代謝產物水平相關的基因組位點。另外，本文鑑定了茄鹼途徑的組成部分，以及參與病原體防禦的基因和代謝物，並將真菌抗性與果實成熟調控網絡的變化聯繫起來。該研究結果為理解番茄果實成熟過程中的代謝和病原菌抗性提供了一個框架，並為研究關鍵果實品質性狀提供了依據。
本研究通過非靶向代謝組學和RNA測序相結合，以及整合QTL作圖群體解析並勾勒出番茄果實成熟過程中次生代謝物和病原菌抗性的遺傳調控網絡。這項研究推測出的基因型-表型關聯將對目前的分子育種做出重大貢獻，有助於對抗風味和抗病性等關鍵水果質量性狀的丟失。
上海鹿明生物科技有限公司，一直專注於生命科學和生命技術領域，是國內早期開展以蛋白組和代謝組為基礎的多層組學整合實驗與分析的團隊。
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Flora 撰文
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