二、氧化磷酸化作用
氧化磷酸化作用（oxidative phosphorylation），是指線粒體中NADH上的一對電子被傳遞到O2時，推動ADP磷酸化形成ATP的作用。Mitchell提出的化學滲透學說能較好解釋電子傳遞與ATP形成的機制。可以將電子傳遞系統看作是一個質子泵，由此產生的質子電化學勢梯度，推動ATP的合成（圖2－7）。線粒體的ATP合成酶（F1－F0複合體）與葉綠體的ATP合成酶相似，具有小球體頭部和柄部。頭部嵌入內膜並伸入線粒體基質內，柄部則橫跨內膜向外伸展到膜間腔。在基質的頭部合成ATP後，ATP通過內膜上的反向運轉體運到膜間腔，同時反方向運轉ADP。線粒體外膜的透性較大，具有允許小於5kD的分子通過的通道。代謝物很容易通過線粒體外膜，ATP通過這些通道進入細胞質中。
如圖2－6所示，由線粒體基質內三羧酸循環產生的內源NADH＋H+首先將2個電子和2個H+傳遞給內膜內側含FMN的黃素蛋白。黃素蛋白將電子傳遞給Fe-S蛋白。由於Fe－S蛋白不接受H+，所以2個H+以某種方式運送到膜間腔。這是電子傳遞鏈上跨膜轉運到膜間腔的第一對質子。第二和第三對質子的跨膜運轉是在UQ從Fe-S蛋白接受2個電子時，從基質中吸收2個H+還原成UQH2，Cyt.b或Cyt.c1隻接受電子，2個H+被運送到膜間腔。最近的研究指出，Cyt.c被細胞色素氧化酶氧化時，伴隨著一對H+從基質運到膜間腔。不過，具體機制還不清楚。
從還原勢（ψ0）來看，NADH的ψ0為-0.32伏，而O2為+0.82伏，總變化△ψ0為+1.14伏。在線粒體中，每氧化1mol由三羧酸循環產生的NADH釋放220kJ的能量，4對H+由線粒體基質跨內膜運轉到膜間腔，產生的pH梯度足夠推動ATP合成酶合成3分子ATP。許多研究也表明，植物的離體線粒體每氧化一分子三羧酸循環NADH，產生3分子ATP。