螢光定量western blots是進行蛋白質定量的金標方法，也是對蛋白質進行多重檢測最理想的方法，能夠實現泳道內（in-lane）檢測內參蛋白和靶標蛋白，並執行歸一化，完美質控蛋白樣品上樣量，使得翻譯後修飾蛋白的研究和定量檢測明朗了許多。
在螢光western blots中，二抗偶聯了螢光基團，經入射光激發後產生特定波長的發射光，檢測器捕獲發射光從而成像，通過軟體即可對圖像進行數據分析。二抗偶聯不同的染料，激發後產生不同波長的發射光，實現同時檢測多重蛋白。
螢光western blots整個操作與化學發光類似，為造福小夥伴們，不必重踏小編的血淚彎路，小編分享10大心得：
1.滴定法確定一抗和二抗使用濃度：使用點雜交和棋盤滴定法確定一抗和二抗最佳濃度。
2.通常一抗使用濃度2-5倍於傳統的化學發光；二抗的使用濃度也需要提高，建議初始稀釋度為1:5000。
3.多重檢測時，需要：
> 先分別對每種靶標蛋白和內參蛋白進行檢測優化；
> 確保一抗物種來源不同，使用血清預處理過的二抗（cross adsorded二抗），避免交叉識別；
> 螢光染料要避免重疊，選擇發射波長距離遠的染料；
4.使用低自發螢光的PVDF膜：NC膜和部分PVDF的自發螢光會到導致高背景，降低靈敏度。
5.使用螢光分子量Marker時，請跳過一個泳道再進行樣品上樣，可以避免Marker擴散到樣品泳道。
6.不要使用產生螢光的標記和染料：使用鉛筆標記印跡膜，避免使用有自發螢光的溴酚藍和考馬斯亮藍染料。
7.所有物品保持潔淨，確保背景無幹擾：
> 成像前請徹底清潔整個設備及託盤；
> 佩戴無粉手套處理凝膠和印跡膜；
> 孵育時請遮蓋託盤；
8.螢光標記的抗體必須避光保存中，防止發生淬滅現象。
9.為了增加特異信號，在藍光通道檢測強信號，在綠光通道檢測中等信號，在紅光通道檢測弱信號。
10.印跡膜歸檔保存需嚴格避光。