哈佛大學的Mooney課題組近期在Advanced Functional Materials期刊上發表了「Biomaterials functionalized with MSC secretedextracellular vesicles and soluble factors for tissue regeneration」的文章,詳細介紹了間充質幹細胞(MSC)分泌的細胞外囊泡和可溶性因子的成分和作用機制,並探討了通過生物材料來遞送MSCs分泌因子的最新進展和挑戰。
MSCs分泌因子
間充質幹/基質細胞(MSCs)是再生醫學中細胞治療的常用細胞類型,在很多臨床前和臨床實驗中證明了組織修復的有效性。儘管MSC具有調控組織癒合的能力,但MSC細胞注射的存留率卻很低。現在,通常認為MSC主要通過旁分泌機制來發揮治療作用。MSC分泌物可以在通過體外培養來收集MSC條件培養液(MSC-conditionedmedia,MSC-CM),其包含可溶性因子(包括細胞因子,趨化因子和生長因子)及囊泡分泌物(亦被稱為細胞外囊泡(EVs))。MSC-CM可以增強體外細胞的增殖、遷移、血管生成,並具有抗凋亡和抗炎症的作用。MSC-CM已在包括皮膚傷口、帕金森病、肝衰竭、和心肌梗塞(MI)等多種臨床前症狀中表現出促進組織癒合的作用。
MSCs幹細胞療法受到有創性細胞提取、來源有限和生產成本高的限制,相比而言,基於MSCs分泌因子(即MSC-CM,包括可溶性因子和細胞外囊泡)的療法具有許多潛在優勢:
i) 可過濾滅菌;
ii) 穩定保存,無需冷凍儲存,且可在解凍後直接使用;
iii) 可冷凍乾燥製成現成的產品,同時保留功能性。
總之,與細胞療法相比,MSCs分泌因子療法可有效降低生產成本。
因此,這篇綜述概述了MSCs分泌的可溶性因子和EVs的成分,並綜述了它們作為無細胞的再生醫學策略的潛力。其中,重點介紹了由MSCs分泌因子介導的組織癒合機制,並論述了體外培養刺激對MSCs分泌因子的影響;然後,聚焦通過生物材料來遞送MSCs分泌因子的最新進展;最後,探討了EVs功能化生物材料的挑戰,包括標準化、擴增性和臨床轉化。
MSC的組織來源
成年MSC可以來源於多種組織,如骨髓和脂肪組織。通常,新生兒組織(如臍帶血和胎盤)作為無創採集的MSC來源,而皮膚成纖維細胞重編程產生的iPSC可以進一步分化為MSC。這些途徑共同提供了具有治療潛力的MSC的來源。一些證據表明,這些組織中的MSC具有血管周起源的特性。此外,還發現了器官特異性的常駐MSC,如在肺,腎和肝臟中,它們參與組織癒合,並可能應用在細胞療法中。
MSC可以通過其塑性粘附,表面標誌物(如CD44,CD73,CD90,CD105)的表達以及三譜系的分化潛能等來鑑定。
圖1. 用於細胞治療的MSC的組織來源。
MSCs分泌的可溶性因子和EVs
可溶性成分包括MSCs分泌的多種生長因子、趨化因子和具有免疫調節、血管生成和抗凋亡功能的激素。MSC-CM中濃度最高的可溶性因子包括血管內皮生長因子VEGF,成纖維細胞生長因子(FGF2),血管生成素-1(AGPT-1),胰島素樣生長因子(IGF-1),胎盤生長因子(PlGF),血小板衍生生長因子(PDGF),轉化生長因子β(TGF-β1),白介素(IL)-6,肝細胞生長因子(HGF),和腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激的基因/蛋白質6(TSG-6)等。
EVs是指細胞分泌的,包含有脂質、蛋白質和核酸的納米顆粒,從而充當細胞間的信使。EVs早期被認為具有細胞間通信的功能,特別是在免疫調節和癌症方面。自從研究發現EVs含有mRNA、miRNA和蛋白質,以及細胞間交換的遺傳信息,相關EVs的研究正成爆炸性增長。
目前,EVs 根據其生物發生過程和大小進行分類:當多囊泡胞內體與質膜融合時,釋放出直徑在50-150 nm的外泌體(exosome),而尺寸通常較大(尺寸在100-1000 nm)的細胞微泡則是通過質膜向外出芽直接釋放。最近研究發現,尺寸約為35 nm的非膜納米粒子,亦被稱為外泌體;而其他囊泡被稱為凋亡小體(尺寸在800-5000 nm),主要是由於程序性細胞死亡過程中,膜起泡而釋放的膜結合囊泡。
在這篇綜述中,使用術語EV來統稱外泌體和細胞微泡,這已得到國際細胞外囊泡協會(ISEV)的認可,因為這兩個子集的尺寸大小存在重疊,並且仍未就每種類型的不同表面標記達成共識。
EV分離方法包括有或沒有密度梯度的超速離心(UC),尺寸排阻色譜法,基於聚合物的沉澱和免疫親和力等方法。當將EVs根據大小分開時,發現小型和大型的EVs 包含不同的蛋白質、mRNA和miRNA成分。當EVs 根據其膜脂分離時,也會觀察到明顯不同的蛋白質和RNA。有趣的是,只有小型EVs 在急性腎損傷模型中顯示出治療效果。
MSC分泌因子調控組織修復的潛在機制
MSC分泌的可溶因子和EV通過協調動員各種細胞類型、激活或觸發多種細胞過程來促進組織再生。2009年在腎損傷模型的研究中,MSCs的治療作用被認為歸因於MSCs分泌的細胞外囊泡(EVs)。不久之後,在心肌缺血損傷的小鼠模型中,通過MSC-EVs的遞送促進了心臟的再生。從那以後,從MSC-CM分離出的細胞外囊泡(EVs)已被證明可有效促進包括心血管、肌肉骨骼、神經、腎、和肺等組織/器官的修復。
受體細胞對EVs 的攝取主要是通過多種內吞、微胞飲、和膜融合作用來介導的。CD81,CD63,CD9,Syntenin-1,Alix,TSG101和flotillin-1是MSC和其他細胞類型分泌的EV相關蛋白質,因此通常用作EV標記物。據報導,MSC-EVs包含約850種不同的蛋白質,超過200個mRNA,和≈60個miRNA。
將EV的核酸、管腔和膜蛋白以及分泌的可溶性蛋白質等根據作用分為四類:抗凋亡因子、細胞遷移和增殖的促進因子、促血管生成分子以及抗炎症因子。一般,由MSC分泌因子誘導產生的這些細胞活動之間相互作用,共同實現組織癒合。
最近的重要工作已確定了EV介導促血管生成、抗凋亡和抗炎症等作用的蛋白質和核酸效應子,它們在促進組織癒合的級聯反應中是不可或缺的。
許多研究者將臨床前研究中觀察到的EV介導的治療作用歸因於其核酸含量。有趣的是,在急性腎損傷的小鼠模型中,RNA酶(RNase)處理過的EVs不具有促進腎臟恢復的作用,暗示RNA才是其主要的治療成分。的確如此,在急性腎臟損傷模型中,EVs的抑纖維化和促組織再生的作用是由EVs中的HGF mRNA介導的;而EVs中的miRNA(如miR-21和miR-494),則可以促進骨骼肌損傷後的肌肉再生和組織癒合。另外,細胞凋亡在組織損傷中起著作用,MSC-EVs已顯示出在臨床前損傷模型中通過減弱細胞凋亡來促進組織再生的能力。
值得注意的是,EVs中的各種生物活性因子和MSCs分泌的可溶性因子具有多種生物效用,因此可能會引起意想不到的副作用。儘管迄今為止尚無關於副作用的報導,不同於全身遞送,MSsC分泌因子的局部遞送將有助於確保任何可能出現的副作用不會擴散至全身。
圖2. MSC分泌因子調控組織修復的潛在機制。
MSC分泌因子的體外調控和材料修飾
調節MSC因子分泌的因素:缺氧,力學環境以及促炎症刺激可誘導MSC分泌更多、具有更高治療效果的EV和蛋白質,還可以對MSC進行基因編輯,來上調部分能促進組織修復的RNA或蛋白質的分泌表達。
EVs可以通過多種途徑進行給藥,包括靜脈內、腹膜內或皮下注射,並且給藥途徑會大大影響EVs在體內的分布。用於組織修復的最常見的EVs遞送方式是直接將EVs局部注射到損傷部位。然而,這可能會導致EVs的快速流失。在某些情況下,在癒合期間EVs的反覆注射是必須的。
使用生物材料遞送EVs已成為一種有前景的再生醫學策略,有助於提高EV的存留率和治療效果。可以通過交聯或與EV位點結合,將EV固定在生物材料中,然後作用於受損組織以誘導癒合和功能恢復。天然ECM生物材料(如膠原蛋白和透明質酸),可以分別通過整聯蛋白和CD44受體與EV結合,而合成生物材料的孔隙率和降解速率則可以進行嚴格調節,來實現EV的可控釋放。與直接注射遞送相比,載EV的生物材料可以實現更高的EV留存率和更好的組織再生效果。
圖3. 體外培養刺激對MSCs分泌因子的影響。
圖4. 通過生物材料來遞送MSCs分泌因子。
總結
相比於MSCs幹細胞療法,基於MSCs分泌因子的無細胞再生療法具有許多潛在優勢。MSCs分泌因子介導的體內組織修復機制主要包括免疫調節、促血管生成、抑制凋亡、和減少纖維化等。通過與EVs位點結合或將EVs包裹在基質材料中,可有效延長EVs在遞送後的存留率,實現長時間的可控緩釋,進而可能增強治療效果。
參考文獻
Brennan, M.., P. Layrolle and D.J. Mooney, Biomaterials functionalized with MSC secreted extracellular vesicles and soluble factors for tissue regeneration. Advanced Functional Materials, 2020: p. 1909125. (DOI:10.1002/adfm.2019091251909125.)