吳濰龍團隊綜述:冠狀病毒RNA校對及藥物治療

2020-12-18 澎湃新聞

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生命科學

Life science

對全球公共衛生和經濟造成嚴重破壞的2019年冠狀病毒疾病（COVID-19）使人們更關注到缺乏有效的抗病毒治療藥物。香港中文大學吳濰龍教授領導香港、英國、越南、法國和土耳其的科學家深入調查冠狀病毒的RNA複製和校對機制，以助新藥研發。相關結果發表在Cell Press細胞出版社旗下期刊Molecular Cell上。

RNA病毒複製通常具有較高的出錯率（較低的病毒保真度），從而導致病毒出現不同的基因組突變體種群存在。低複製保真度使RNA病毒適應選擇性壓力，但同時也增加了導致死性突變的機會。這表明病毒需要在準種多樣性與複製適應性之間達到微調的平衡，以適應病毒的毒力和進化。這個因素挑戰了抗CoV和其他RNA病毒的抗病毒藥物開發，尤其是核苷類似物（NA），因病毒可快速發展對藥物的耐藥性同時保持病毒的複製適應性。另外，NAs開發的障礙是獨特的CoV 核酸外切酶（ExoN）校對機制。SARS-CoV nsp14-ExoN突變體比野生型突變體積累多達20倍的突變，因此nsp14的核酸外切酶校對功能可能是成為複製能力的關鍵因素。該文章探討了CoV校對複合物的分子基礎，並評估將現有的核苷類似物和新的基因組技術視為潛在的抗冠狀病毒治療劑，可單獨使用或結合使用以靶標向校對機制。

非結構蛋白nsp14校對複合物

Nsp14是一種60 kDa雙功能酶 。nsp14 C端N7-MTase結構域包含在CoV中保守的DxG S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）結合基序，並參與mRNA加帽和先天免疫反應逃避，而nsp14 N端具有一個與複製保真度有關的N末端3'-5'核酸外切酶（ExoN）結構域，通過從延伸的RNA鏈的3'末端去除錯配的核苷酸來糾正 RNA依賴性RNA聚合酶 (RdRp) 產生的錯誤。其中，ExoN結構域內的四個保守催化殘基Asp90，Glu92，Glu191，His268和Asp273 屬於DEDD核酸外切酶超家族，形成兩個金屬結合位點，通過兩個分子來驅動核苷酸切除金屬離子輔助工藝。研究顯示，鼠肝炎病毒（MHV）和SARS-CoV病毒ExoN突變體可以在細胞培養物中複製具有生長缺陷，更高的突變密度和突變率。另外， Ogando等測試了多種MERS-CoV ExoN突變體中只有一個ExoN突變體能夠在細胞培養物中複製。而且，ExoN野生型和Exon-D191E突變體顯示出對誘變劑5-FU相當的敏感性，而突變體的敏感性僅比WT略有增加。這些數據反影了ExoN在CoV中除了校對機制，可能更具有基本的RNA合成機理。

核苷類似物（Nucleoside Analogs）

核苷類似物（NAs）可通過兩種方式方式發揮其抑制作用﹕1）導致天然核苷酸錯配，導致RNA鏈錯誤同化及基因組出現致死性突變；2）它們的摻入可能會提前終止正在延伸的RNA或DNA鏈。重新利用現有的抗病毒藥物（已批准的和實驗的藥物）對抗冠狀病毒已被認為控制冠狀病毒爆發的有效療法的最快策略。許多研究顯示NAs具有抗CoV活性 (表一) 。

▲表一: 具有抵抗冠壯病毒的潛能的核苷類似物

尾注﹕ VEEV﹕委內瑞拉馬腦炎病毒；MERS-CoV﹕中東呼吸症候群冠狀病毒；SARS-CoV﹕嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒；HAE﹕人氣道上皮細胞

NAs作為藥物存在許多局限性，如NA通常作為前藥提供，一旦進入細胞，必須將其磷酸化為三磷酸形式才能被聚合酶識別。而且，將NA轉化為單磷酸酯形式的第一個磷酸化反應通常是限速的，因此NA可能無法被識別並且似乎沒有活性。另外 ，在一項研究中發現雖然SARS-CoV對利巴韋林（RBV）和誘變劑5-氟尿嘧啶（5-FU）均具有抗性，但敲除ExoN功能導致對化合物的敏感性提高了300倍，這表明冠狀病毒在RNA合成過程中ExoN去除錯配核苷酸的獨特能力已導致冠狀病毒對許多NA的天然抗性。因此，非常有必要對可能逃避ExoN校對活動的NA進行合理設計。

反義寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides）

反義寡核苷酸（ASO）是約20個核苷酸的單條DNA鏈，並可以誘導宿主RNase H酶催化的mRNA切割，改變剪接或形成空間阻斷來破壞RNA翻譯，從而破壞目標蛋白的表達(圖一)。由於ASOs對各種核酸酶具有抗性，因此在細胞和細胞外環境中都可以穩定運行數小時,ASOs非常適用於體內模型和臨床應用。Rocchi等證明脂質的ASO（LASO）具有自組裝成納米膠束的能力，無需轉染劑即可有效吸收ASO。這些LASO納米結構可以封裝疏水化學療法並協助其遞送，可使化合物在水中的溶解度更高，並提高了化合物的功效。形成的雜化納米膠束的理化特性亦可以以吸入氣霧劑進行給藥，顯著降低毒性並將抗病毒化合物靶向肺部。例如，在抗病毒LASO納米複合物中封裝NAs（如RDV）可作為組合療法，與NAs同時遞送特定的ASO，能增強NAs或其他抗病毒治療的效果。

▲圖一: 反義寡核苷酸(ASO)技術治療冠狀病毒

ExoN 3'-5'核酸外切酶的活性是冠狀病毒生命周期中許多過程的關鍵因素，並且使一些以往成功的抗病毒化合物對CoV無效。值得注意的是，抑制ExoN校對活性的主要結果是致命誘變，而病毒校對機制的選擇性靶向可能引致非想望的選擇壓力，導致出現少數甚至更具活力的突變菌株。由於ExoN在CoVs中在結構和功能上均是保守的，並且該因素加上病毒基因組中功能的冗餘性缺失，使ExoN成為抗CoV策略的易受攻擊目標。通過核酸基因技術的方法抑制ExoN活性，同時用已批准的NAs進行治療，可以增強NAs的有效性，從而降低病毒複製的保真度，從而減輕疾病。使用這樣的治療策略，將具有不同作用方式或在病毒複製過程中幹擾不同過程的藥物結合起來，也可能會增加耐藥性的障礙。

論文作者介紹

吳濰龍

教授

香港中文大學藥學院吳濰龍教授的研究方向為化學生物學和藥物研發。其實驗室使用化學，分子生物學和生物信息學工具開發新的化學小分子，用於治療和診斷各種人類疾病，包括癌症，糖尿病， 冠狀病毒感染和神經退行性疾病。吳濰龍教授在香港中文大學獲得化學學士（一等榮譽）和博士學位，亦曾是麻省理工學院（MIT）的富布賴特學者。從2014年至2016年，他獲裘槎基金會資助加入牛津大學，擔任化學系博士後研究員。從2016年至2019年，他被聘為哈佛醫學院/ Dana-Farber癌症研究所的研究員。其近年的研究成果發表於 Science, Nature Chemical Biology,Cancer Discovery,Molecular Cell,Journal of the American Chemical Society 以及 Angewandte Chemie 等著名國際期刊。

相關論文信息

相關結果發表在CellPress期刊Molecular Cell上，

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▌論文標題：

Coronavirus RNA proofreading: molecular basis and therapeutic targeting

▌論文網址：

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(20)30518-9

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.07.027

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