2017年，Kymriah與Yescarta的獲批上市宣告了CAR-T療法時代的到來，也讓我們看到了基因編輯與細胞療法的無限潛力。7月12日，一篇發表在《自然》期刊上的研究，則有望進一步加快細胞療法的研發進程。業內諸多專家們表示，這可能會給細胞療法領域帶來重大變革。
病毒載體的應用和瓶頸
目前上市的兩款CAR-T療法，其使用的基因編輯技術均依賴於病毒載體。這是對病毒的一次成功改造——很久以前我們就知道，病毒的遺傳物質能穿透細胞膜，進入到細胞內，引起感染。這個特性引起了科學家們的興趣。在1970年代，「生物黑客」們移除了病毒中的致病部分，將它們改造成了遞送遺傳物質的工具。「病毒載體」一詞也由此誕生。如今，這些病毒在基因療法和細胞療法中得到了廣泛的應用。
▲目前獲批的CAR-T療法，使用的都是基於病毒載體的編輯技術（圖片來源：諾華官方網站）
儘管基於病毒載體的先進療法在研發上取得了諸多突破和進展，也讓我們看到了創新基因療法和細胞療法井噴的希望，但病毒載體本身卻有著成本高、周期長的瓶頸。此外，單靠病毒載體也無法將基因精準地插入到所需的位置，能帶來潛在風險——它們可能會影響到健康基因的表達，或是導致插入基因被異常調節，出現失控。這些風險都是高懸於病毒載體頭上的達克摩利斯之劍，使我們在基因療法和細胞療法的研發上不得不慎之又慎。
「人們花了30年的時間，想要把基因轉入到T細胞中。」該研究的第一作者，正在攻讀MD/PhD學位的Theo Roth說道。他指出，為了開發用於T細胞編輯的病毒載體，即便有6-7名科學家辛勤工作，也要花上約數月，甚至是一年來進行開發。如果能找到一種不使用病毒載體，但依然能對細胞進行有效編輯的方法，無疑將極大地加速先進療法的開發。這對整個領域而言，可能帶來革命性的變化。
▲本研究的第一作者Theo Roth（圖片來源：UCSF）
而本篇《自然》上公布的方法看起來簡單得不可思議：誰也沒有想到，幾十年前就在微生物研究中大放異彩的電穿孔技術（electroporation），竟能在細胞療法的開發上煥發光彩。
「海格力斯的試煉」
許多看似簡單的成果背後，往往有著常人難以想像的枯燥工作，這項研究也不例外。儘管在幾十年前，我們就在微生物中嘗試了電穿孔方法來引入外源DNA，但這種方法先前尚未在細胞療法裡得到廣泛應用，不是沒有原因的。
在電穿孔技術中，研究人員們會給細胞施加一個電場，瞬間增加細胞膜的通透性，讓雙鏈DNA進入細胞。但在T細胞內，一旦引入較長的雙鏈DNA片段，竟會導致這些細胞的死亡。在經過大量的嘗試後，許多科學家們都放棄了這個挑戰。他們認為，較長的雙鏈DNA會對T細胞產生毒性。相比之下，引入單鏈寡核苷酸則更具可行性。
但Theo則不信這個邪。從之前的一些研究結果中，他敏銳地觀察到，如果在電穿孔技術中同時應用CRISPR-Cas9系統與雙鏈DNA模板，就有望能減少雙鏈DNA相關的細胞毒性。這給他的研究帶來了突破口，也帶來了更多的問題：CRISPR和DNA的最佳比例是多少？DNA的質量需要多高？這些T細胞需要特殊培養嗎？電穿孔所使用的電流強度是多少？只有各個條件都得到了優化，我們才能有效地使用這種簡便的方法，去改造T細胞。
▲數千次的失敗，才帶來了這套完善的改造流程（圖片來源：《自然》）
除了挨個嘗試之外，Theo沒有其他選擇。
該研究的負責人Alexander Marson教授認為，Theo的堅守對成功至關重要。儘管主流學界都相信T細胞只能耐受小片段的DNA，都相信病毒載體不可或缺，但Theo不懼權威，「展現出了海格力斯般的努力，測試了數千種不同的條件」。
▲利用這套系統，研究人員們可以「隨心所欲」地將綠色螢光蛋白表達於細胞的不同部位（圖片來源：《自然》）
成功建立在數千次失敗之上。經過近一年的反覆嘗試，Theo終於總結出了一套行之有效的方法，並成功證明這套不使用病毒載體的系統，能成功對基因組進行高效編輯。在概念驗證性的實驗中，這支團隊成功讓綠色螢光蛋白按照需求，在細胞核、細胞膜、細胞骨架、以及細胞器中特異表達。
更令人印象深刻的是，這套系統能將原來需要花費數月甚至數年的工作，縮短到僅僅幾周！
臨床應用的曙光
為了進一步驗證這套系統的潛力，研究人員們又做了兩個實驗。在第一個實驗中，他們從罹患罕見自身免疫疾病的患者中取得了T細胞。基因組測序結果表明，這些T細胞的IL2RA基因帶有突變，讓它無法行使正常功能。因此，患者體內的調節性T細胞會出現發育異常，無法有效地控制免疫系統，從而讓它對自身展開攻擊。
利用他們開發的新型技術，這群科學家們快速地修復了T細胞中的IL2RA基因缺陷，重塑關鍵的細胞通路。
出於安全性上的考慮，研究人員們沒有將經改造的細胞輸注回患者體內。但類似於CAR-T療法，未來，我們有望在體外修正患者的T細胞，並在擴增之後，重新輸注給患者，治療他們的自身免疫疾病。
▲經過這套系統改造的T細胞能特異性聚集在腫瘤附近，且與病毒載體改造的細胞有類似的效率（圖片來源：《自然》）
在第二項研究中，科學家們則把目光投向了癌症的治療。他們從健康人體內獲取了T細胞，並更換了它們的T細胞受體，使這些細胞能特異性地攻擊某種人類的黑色素瘤細胞。
在培養皿中，這些T細胞能有效地靶向黑色素瘤細胞，而不會識別其他類型的細胞，表明了其特異性。而在小鼠的腫瘤模型裡，這些具有全新受體的T細胞也同樣能聚集在腫瘤位點，展現出抗癌的活性。
「這是一種快速、靈活的方法，能對T細胞進行改造、增強、以及重編程，使我們能賦予這些細胞各種特異性，用來摧毀腫瘤，識別感染，或是減少它們的免疫反應，治療自身免疫疾病，」 Marson教授補充道：「現在，我們參與到了所有的前沿領域中。」
這項成本更低，且能在短短數周內完成自定義T細胞改造的方法，得到了許多業內專家的看好。如果它能在細胞療法的開發上得到更多應用，無疑將有潛力改變當下的研發格局。近期，美國FDA出臺了一系列針對基因療法和細胞療法的政策，鼓勵這些先進療法的研發。我們期待在這個激勵創新的大環境下，更多突破性的技術能得到轉化，為全球患者帶來更多有效療法。
原標題：Nature重磅：細胞療法將迎重大變革？新技術可將基因編輯縮短至幾周