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肺炎雙球菌轉化實驗是考試中經常出現的考點，實驗看似簡單明了，內容仔細去思考就會發現很多疑難問題要解決。
一．格裡菲斯的體內轉化實驗
實驗中將加熱殺死的S型和活的R型混合注射到小鼠體內，小鼠患敗血症死亡，並從小鼠體內分離出活的S型，且其後代仍是有毒性的S型。格裡菲思推論：在已經加熱殺死的S型細菌中，必然含有一種「轉化因子」，促使R型轉化為S型，且這種轉化可遺傳。
質疑一：是S型復活還是R型被轉化？
學生的質疑：為什麼是R型被轉化，而不是加熱殺死的S型復活呢？
分析解答：學生提出這樣的質疑，主要是對蛋白質的化學性質不太了解。蛋白質具有一定的空間結構才具有生理活性，加熱會破壞蛋白質的空間結構（變性），且該過程不可逆。所以加熱後蛋白質變性失活，不可能再恢復其功能（可以高溫下酶失活為例）。而蛋白質是生命活動的承擔者，蛋白質失活了，生命活動就不可能再恢復，也就是說熱殺死的S型是不可能復活的。
質疑二：加熱殺死的S型的DNA為什麼沒被破壞還可以發揮轉化作用？
學生的質疑：加熱殺死的S型菌的蛋白質變性失活了，失去了生理功能。那為什麼熱殺死的S型的DNA還有作用呢？
分析解答：學生提出這樣的質疑，和上一個問題的原因相似，主要是對DNA的結構及化學性質不太了解。DNA是由兩條鏈形成的雙螺旋結構，兩條鏈間鹼基通過氫鍵連接。加熱會使氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋解開成單鏈，稱為DNA變性。但和蛋白質變性不同的是，當溫度緩慢降低時單鏈又可以重新形成雙鏈，稱為DNA復性。所以，加熱殺死的S菌的DNA還是有作用的。
質疑三：轉化因子是S型菌的整個DNA，還是DNA片段？
學生的質疑：發揮轉化作用的到底是S型菌的整個DNA，還是DNA片段？
分析解答：這個問題涉及的是DNA分子變性、復性、以及基因的有關知識。通過查閱資料發現：常用的DNA變性方法主要是熱變性方法和鹼變性方法。熱變性使用得十分廣泛，但是高溫可能引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈DNA。而鹼變性方法則沒有這個缺點，在pH為11.3時，全部氫鍵都被淘汰，DNA完全變成單鏈的變性DNA。
決定生物性狀的基本單位叫做基因，它是核酸上具有遺傳效應的片段。S菌的DNA上具有與莢膜形成有關的片段（基因），加熱殺死S菌時，S型菌的DNA可能因高溫引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈DNA。所以加熱殺死S菌的時候，會得到與莢膜形成有關的DNA片段。該片段與R菌DNA整合後，使得其也可以形成莢膜，即轉變為S型。
質疑四：S菌的DNA將R菌轉化，還是S菌的DNA直接控制合成了S菌？
補充證明RNA是遺傳物質的實驗──菸草花葉病毒侵染實驗。學生在知道菸草花葉病毒的RNA侵染菸草細胞後，利用其所帶的遺傳信息控制合成了新的菸草花葉病毒的知識後，對肺炎雙球菌體內轉化實驗又提出了新的質疑。
學生的質疑：為什麼是S型菌的DNA轉化了R型，而不是S型菌的DNA像菸草花葉病毒的RNA侵染菸草細胞後直接控制合成了S菌？
分析解答：學生發生這樣的疑問是因為對病毒的結構和複製、細菌的結構和繁殖的知識掌握的不夠清晰，不能區分這兩種生物的特徵。病毒是非細胞結構的生物，由蛋白質外殼和核酸組成，子代病毒是通過病毒核酸（遺傳物質）在宿主細胞中控制合成的核酸和蛋白質組裝而成。而細菌是細胞結構生物，細胞通過分裂實現增殖，也就是說新細胞只能來自於細胞的分裂，而不可能來自於其他細胞直接合成。所以該實驗中應該是S型菌的DNA轉化了R型菌，而不是像菸草花葉病毒侵染實驗那樣直接控制合成了S菌。
質疑五：殺死的S型細菌為什麼不會使小鼠死亡，而加入R型細菌之後小鼠就死亡了？
1933年，阿洛維將II-R型細菌和III-S型細菌的無細胞提取液（所有完整細胞、細胞碎片、莢膜分子都通過離心和過濾從提取物中去掉）混合，培養皿上仍長出了III-S型細菌。這否認了R型細菌以某種方式使加熱殺死的S型細菌「復活」。而是S型細菌細胞提取物中含有轉化因子，並且它的化學本質還是未知的。必修二裡對于格裡菲斯所做的實驗的結論也是：加熱殺死的S型細菌中，必然含有某種促成將R型細菌轉化形成有毒性的s型活細菌的活性物質，而這一個活性物質命名叫做「轉化因子」，後來被證實這個轉化因子是S型細菌的遺傳物質——DNA。雖然在加熱過程中，s型細菌已經死了，但是它自身的遺傳物質還沒有失活，只是蛋白質失活了而已，它的DNA可以整合到R型細菌的遺傳物質中，並且繼續發揮自身的作用，利用R型細菌提供的材料，隨著R型細菌的增殖而增殖，並指導S型細菌的蛋白質的合成，最終表現出S型細菌的毒性。也就是教材中所說的：產生產莢膜的S型肺炎雙球菌，導致小鼠最終患敗血症而死亡。而殺死的s型細菌由於蛋白質失活而失去感染性，不能使小鼠死亡。
質疑六：為什麼能發生轉化，是將R型細菌殺死變成S型細菌的？還是兩者的遺傳物質進行融合後表現出S型細菌的特點？有沒有可能是R型細菌突變而來？
首先對轉化這一名詞進行解釋：轉化是某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型細胞的DNA，而使它的基因型和表現型發生相應變化的現象。這現象首先發現於細菌，也是細菌間遺傳物質轉移的多種形式中最早發現的一種，它不同於通過噬菌體感染傳遞遺傳物質的轉導以及通過細菌細胞的接觸而轉移DNA的細菌接合。
細菌轉化過程包括有轉化能力的染色體DNA片段的吸附、吸收和整合3個階段。外源DNA首先吸附在細菌細胞表面的一些接受位點上，能吸附的DNA主要是雙鏈狀態的，在通過細胞膜進入細胞的吸收過程中DNA分子轉變為單鏈，並與R型細菌內的同源區段配對，形成雜合區段，接著發生錯配鹼基對的修復校正：如果是以s型細菌的DNA作為模板進行修復，那S型細菌的DNA就會以這種形式整合到細菌染色體上。外源基因整合後，通過基因表達使受體細菌的表型發生相應的變化，如果整合到R型細菌中的DNA正好含有控制莢膜形成的基因，則會表現出有莢膜的特性。
所以，格裡菲思把不產莢膜的無毒的粗糙型肺炎雙球菌和加熱殺死後的產莢膜的有毒的光滑型肺炎雙球菌混合注射小鼠，發現小鼠被感染致死，從小鼠的血液中分離出活的產莢膜的S型肺炎雙球菌，而且是與加熱殺死的S型細菌相同的Ⅲ-S型，因此這些S型細菌不可能是通過這些特定的R型細菌突變而來的。R型細菌之所以能產生S形的性狀，是發生了「轉化」，簡單說，轉化就是R型細菌接收了S型細菌的DNA，把它的DNA整合到了自己的DNA上面，獲得了S型細菌的形狀，長出莢膜。
而要注意的是，在這個過程中，不可能生成S型細菌，因為S型細菌也是一個獨立的菌種，有自己的特異的染色體、細胞質等，它的染色體只可能被吸收，部分整合到R型細菌的染色體上，導致R型細菌的染色體不可能完全表達，因此產生S型細菌的性狀，而不是真的轉變成s型細菌。
質疑七：S型細菌的DNA非要用R型細菌當宿主細胞嗎，它怎麼不能用小鼠體內的細胞當宿主細胞來進行增殖嗎？
首先，受體細菌和供體細菌的親緣關係會產生影響。當親緣關係愈遠，轉化效率愈低，這主要是受吸附位點專一性和染色體的同源程度的影響。DNA分子的聯會是供體DNA整合到受體DNA上的先決條件，聯會一般只發生在同源染色體之間，而親緣關係愈遠則同源性愈低，所以轉化效率也愈低。因此對比起來，S型和R型細菌之間DNA的差異相對小鼠來講要小得多，在轉化過程中當然是R型細菌具有優先性，所以一般以R型細菌的細胞作為受體細胞。
其次，任何細胞都有自己的保護系統，沒有保護的DNA進入外源細胞就會被降解，而不會表達。小鼠細胞，更能識別S型細菌的DNA是外源DNA。再者，加熱殺死的S型細菌就算用小鼠體內的細胞當宿主細胞增殖，它本身無莢膜，無毒性，會被小鼠免疫系統殺死。
還有，真核細胞和原核細胞的表達系統也有差別，真核細胞的核糖體是80S（包括60S與40S的大小亞單位），而原核細胞是70S（包括50S與30S的大小亞單位），所以S型細菌表達出來的基因在真核細胞裡面不一定能順利的進行表達。
質疑八：R型細菌發生轉化後，R型細菌和S型細菌的數量比例哪個多？
試題：英國科學家格裡菲思將無毒性R型菌與加熱殺死的S型細菌混合後，注射到小鼠體內，小鼠患敗血症死亡。請問在小鼠體內可找到下列哪些類型的細菌（ ）
A.有毒R型 B.無毒R型 C.有毒S型 D.無毒S型
此題情境是肺炎雙球菌的體內轉化實驗，要注意課本中介紹肺炎雙球菌的轉化實驗分為體內轉化和體外轉化實驗。在艾弗裡的體外轉化實驗中，原來培養基裡全為R型細菌，R型細菌吸收外緣DNA發生轉化並非100%，並且轉化後的S型細菌繁殖的後代又有一半是R型細菌，所以在體外轉化實驗中是R型細菌多而S型細菌少。
補充幾個小問題：
1.肺炎雙球菌是否只有S和R兩種？
2.S和R兩種肺炎雙球菌屬於同一物種嗎？
3.S型肺炎雙球菌使人得什麼病？小鼠得什麼病？
4.S型肺炎雙球菌表面有莢膜而呈現光滑嗎？
5.莢膜的成分是什麼？是基因表達的直接產物嗎？
二．艾弗裡的體外轉化實驗
艾弗裡和他的同事為了弄清轉化因子是什麼，分離提取了S菌的DNA、蛋白質和多糖等物質，然後分別加入已培養R型細菌的培養基中，結果發現：只有加入DNA，R型細菌才能轉化為S型細菌。艾弗裡還發現：如果用DNA酶處理S型菌的DNA，使DNA分解，就不能使R型細菌發生轉化。
質疑一：如果在S菌的培養基中加入R菌的DNA，S菌能否被轉化為R型？
學生的質疑：如果在S菌的培養基中加入R菌的DNA，S菌是不是也能整合R菌的DNA，從而被轉化為R型？
分析解答：由於缺乏相應的微生物知識，對R型細菌轉化的具體生理過程不清楚，很容易認為在S菌的培養基中加入R菌的DNA，S菌也能整合R菌的DNA，從而被轉化為R型。
R型細菌之所以能整合S型菌的有關DNA片段，轉化為S型，與其自身的結構和特性有關。R型活菌在對數期後期內處於「感受態」（細菌能從環境中攝取DNA進行轉化的狀態，稱感受態。對於感受態本質的解釋，有人認為處於感受態的受體菌局部失去了細胞壁，使外源DNA能順利經膜進入菌體，稱局部原生質體假說。也有人認為是受體細胞表面出現了一直能結合DNA並使之進入細胞的酶，稱酶受體假說）。被加熱殺死的S型肺炎雙球菌（供體菌）自溶，釋放出自身的DNA片段，當DNA片段遇到感受態的R型活肺炎雙球菌（受體菌）時，R型活肺炎雙球菌（受體菌）細胞膜上的結合位點相結合，隨後其中一條鏈被細胞膜上的核酸酶降解，降解產生的能量協助把另一條單鏈推進受體細胞（該過程稱為DNA的結合和攝取）。當單鏈進入受體菌細胞後，便與受體菌DNA上的同源區段發生交換重組。再通過受體菌DNA複製、細胞分裂，而表現出轉化的性狀，於是就由R型肺炎雙球菌產生出S型肺炎雙球菌的後代。
而S型肺炎雙球菌有莢膜，無感受態，不能作為受體菌，所以在S菌的培養基中加入R菌的DNA，S菌不能被轉化為R型。當然S型菌在自然狀態下或人工的誘變下發生基因突變，S型菌可能突變為R型，但不是轉化。
質疑二：艾弗裡的第三組實驗（加DNA水解物）為什麼沒能排除人們對其實驗的懷疑？
學生的質疑：艾弗裡在第三組實驗（加DNA水解物）中，用DNA酶處理提取的DNA，然後加入培養R型菌的培養基中，結果培養基中未出現S型。這個實驗從反面證明了DNA是遺傳物質，為什麼不能排除人們對提取的DNA中含有0.02%的蛋白質起到了轉化因子（遺傳物質）的作用的懷疑？
分析解答：這個推理從理論上來說確實沒錯，但是實際上，當時情況要複雜的多。當時人們對艾弗裡實驗結果表示懷疑的原因主要來自兩個方面。
一方面：艾弗裡的實驗並非無懈可擊，人們發現他的第一個實驗中的DNA純度不夠，關鍵性的實驗證據出現了問題，由此證據得到的推論自然會被人們懷疑。儘管艾弗裡的第三個實驗能做出一些解釋，但是人們仍然可以認為是DNA和蛋白質共同作用完成細菌的轉化，或者蛋白質也參與了細菌的轉化過程，即無法完全排除蛋白質可能起了作用的懷疑。
另一方面：艾弗裡由實驗推論得到DNA是使R型細菌發生遺傳改變的物質，這個觀點與當時大多數科學家的觀點是截然不同的，因此很多人都不願承認艾弗裡的實驗結果，這一點從他一生的遭遇就可以看出。自1930年起，幾乎每年艾弗裡都因發現肺炎雙球菌的抗原特異性取決於其多糖莢膜而獲諾貝爾獎提名，但由於當時人們普遍認為抗原特性取決於細胞表面的蛋白質，不相信艾弗裡的結果，懷疑其結果是因為多糖摻雜了蛋白質雜質導致的。在1946年以前，艾弗裡有4次進入了第二輪名單，即諾貝爾獎委員會對其工作做了書面評價，但是評價的結果都認為他的發現不值得獲獎。1946年起，開始有人在提名艾弗裡時提到他對遺傳物質的研究。當時研究核酸的兩個權威──卡羅林斯卡醫學院的化學教授艾納·哈馬斯登和他的前學生，細胞研究與遺傳學教授託布真·卡佩森。這兩個人都相信只有蛋白質才有可能是遺傳物質，而且他們根據自己的研究經驗，知道很難除去DNA中的蛋白質雜質，從而不相信艾弗裡的實驗結果。1946年，由哈馬斯登對艾弗裡的實驗做了簡短的書面評價，他對艾弗裡的結果持批評態度，認為艾弗裡的DNA是被蛋白質雜質汙染了，蛋白質才是轉化因子。
接下來的幾年，有一些實驗室用其他實驗證實了艾弗裡的結論，艾弗裡的發現已獲得了獨立驗證。1952年，艾弗裡再次進入了諾貝爾獎第二輪提名名單，由細菌學教授伯恩特·馬爾姆格倫對之做了書面評價。馬爾姆格倫綜述了這幾年來的有關研究，認為蛋白質不太可能是轉化因子。但是他的結論卻是，要把DNA作為轉化因子仍然缺乏最後的證據，因此認為艾弗裡的發現目前不值得獲獎。
補充幾個小問題：
1． 艾弗裡是否提取了S型肺炎雙球菌體內各種有機物分別去轉化R型菌？
2． 轉化後形成的S型菌是否帶有R型菌的遺傳物質？
3． 轉化後形成的S型菌後代中還有R型菌嗎？為什麼？