蒙臺梭利1870年8月31日出生於義大利安科納省的席亞拉瓦萊鎮。父親亞歷山德羅是個思想保守的貴族後裔，年輕時從過軍，後來是文職人員。母親雷尼爾是個虔誠的天主教徒，心地善良，對蒙臺梭利個人的志向一直給以支持和鼓勵。蒙臺梭利是個獨生女，但其父母並不溺愛她，對她規定了嚴格的紀律。小時候，蒙臺梭利每天要做的一項工作就是打掃一些場所，並使它們保持整潔。她對周圍的窮人特別同情和關心。有時候，她還充當正在爭吵的父母的調解人，使家庭保持和諧的氣氛。
6歲時，蒙臺梭利進入安科納的聖尼科洛小學接受初等教育。當時義大利的學校教育狀況是令人沮喪的。蒙臺梭利在學校的表現並不十份突出。據說，她被認為是一個溫柔的但並不特別聰明的小女孩。但是，在早期的學校生活中，蒙臺梭利已萌發了關心和照顧未來的兒童的思想，並表現出強烈的個人尊嚴感。應該看到，蒙臺梭利的早期生活對她以後的幼兒教育實踐及理論的形成也有一定的影響。
12歲時，蒙臺梭利的父母為了使她受到更好的教育，把家搬到了羅馬。有一個時期，蒙臺梭利像其他女孩子一樣想成為一名演員。後來可能受到當銀行會計的父親的影響，她又開始對數學產生了濃厚的興趣，並在數學方面表現出卓越的才能。從那個時候起，蒙臺梭利對自己的未來也有了一些考慮。因此，在中學畢業前夕，當其父母都希望她能選擇義大利婦女的傳統職業當老師時，蒙臺梭利毫不遲疑地說：「除了老師，任何一個職業都可以」。表現了她的獨立精神。
1886年（蒙臺梭利16歲），蒙臺梭利進入高等技術學院，學習現代語言和自然科學，但她喜歡的和學得最好的是數學。她父親仍要她畢業後當一名教師，而她決心要像班上的男同學一樣成為一名工程師。但是，當蒙臺梭利快從技術學院畢業時，由於對生物學的強烈興趣，使她產生了學習醫學的想法。女子讀醫學在當時的義大利是前所未聞的，因此，親戚和朋友都感到驚訝，不支持她的想法，尤其是她的父親。
蒙臺梭利不顧家人和社會輿論的反對，決心學醫。她曾約見當時羅馬大學臨床醫學教授巴克西裡。他們進行了一次愉快的談話。臨走時她與教授握手告別，並堅定地說：「我知道我將成為一名醫生。」1890年秋，蒙臺梭進入了羅馬大學醫學院，成為義大利教育史上第一個學醫的女生。她客服了種種困難，勤奮學習，每年都獲得獎學金。為了能自己解決完成學業所需的費用，她還兼任家庭教師。與一些同學不同，在學習期間，她更感興趣的是醫學實踐而不是醫學學位。經過競爭，蒙臺梭利得到了在兒童醫院當助手的職位，這使她在從醫學院畢業之前就已獲得了一些臨床經驗，特別是在幼兒疾病方面。另外，由於羅馬大學環境的影響，她也開始考慮社會改革問題以及怎樣為社會作出貢獻。
當時，每一個畢業生畢業前都必須在大班作一在公開演講。蒙臺梭利的演講十分出色，內容充實，再加上她本人的魅力，使演講獲得了成功。被友人拖去聽演講的她的父親也受到了人們的祝賀，這使得他們父女之間原有的隔閡頓時消失。1896年春，蒙臺梭利所寫的一篇有關精神病例的畢業論丈獲得通過， 她終於成為羅馬大學醫學院的第一個女畢業生， 成為義大利的第一位女醫學博士。
隨即在羅馬大學附屬醫院任精神病臨床助理醫生，診斷和治療身心缺陷兒童，開始對低能兒童的研究發生了興趣。她深入研究和檢驗了伊他（Jean itard）和塞貢（Edward Seguln）的教育低能兒童的方法，在此期間，曾去巴黎和倫敦參觀和訪問有關低能兒童的教育機構。